Análise mutacional do gene COL7A1 nos pacientes brasileiros e terapia gênica para epidermólise bolhosa distrófica recessiva com macrófagos modificados com COL7A1 em modelo murino

Abstract

Recessive Dystrophic Epidermolysis BulIosa (RDEB) is a very aggressrve monogenic disease whose lack of colIagen VII cause blisters and lesions in all epithelia. There is no effective treatment to date and diagnosis of the disease is still only clinic in Brazil. Due to the large variability sets of mutations and various types of epidermolysis described, sequencing the COL7AI gene would be essential to complete the diagnosis. However, the sequencing is not included in the diagnostic criteria and not available to all patients RDEB, since the variability of change complicates the analysis ofthis very large gene by simple and inexpensive techniques. Using the next generation sequencing (NGS) to analyze the COL7AI gene, we identified the mutations in 26 patient's gene and 22 were RDEB patients. Six novel mutations were identified (c.8047-I G>A, c.l758_1758delC, c.2783_2784insGACAC, c.2903C>T, c.3649G>A e c.8191G>T), being two of them were found in more than one genetic allele (c.l758_I758deIC, c.2783 _2784insGACAC). The most frequent mutation and more frequently alIelic (25%) was the c.5047 C>T. Ten patients had homozygous mutations and nine are resulting from inbreeding. The splice site mutations c. 830~+ 1 G>A e c.8047-I G>A were identified through the introns sequencing, and can be exon skiping therapy or gene edition target, avoiding the entire COL7AI gene insertion, a laborious processo As RDEB patients suffering exclusively from colIagen VII deficiency, " macrophages were modified to express the COL7AI gene under the control of a synthetic specific promoter - the Scavenger promoter. Thinking of a clinical protocol in the future, non-viral Sleeping Beauty system was chosen for gene integration. Initially nuc1eofection was tested in hematopoietic stem cells from mice (HSC) and primary mouse macrophages (PMM). In vitro a high expression of type VII collagen was seen after transfection of pT2-SP-CoI7 vector in HEK293T cells and in PMM but HSC have not remained viable after nucleofection. For in vivo experiments in knockout animaIs for the COL7AI gene (COL7AI - / - mouse), the PMM were nucleofected with pT2-SP-CoI7and pCMVSBIOOX (expresses Sleeping Beauty) and labeled with CM-Dil. Intradermal and intraperitoneal injection was carried out in newbom COL7AI - / - mouse. There was an increase in survival of treated animaIs ranging from 7 to 21 days depending on the type of treatment. None of the animaIs had wounds or blisters during the evaluation period, but had size and weight corresponding to half ofthe WT mouse. The PMM injected were located in the human skin and collagen VII was seen intracellular and in extracellular. matrix. In mice that received the cells intraperitoneally, collagen VII expression and macrophages were seen in spleen, intestine and skin, indicating that there were migration of the PMM to the skin. So macrophage therapy expressing collagen VII proved to be very promising in improve survival oftreated COL7Al -1- mice.

A Epidennólise Bolhosa Distrófica Recessiva (EBDR) é uma doença monogênica muito agressiva cuja ausência de colágeno VII causa bolhas e lesões em todos os epitélios. Não há tratamento eficaz até o momento e o diagnóstico da doença ainda é apenas clínico no Brasil. Devido à grande variabilidade de conjuntos de mutações e os diversos tipos de epidennólises já descritos, o sequenciamento do gene COL 7AI seria essencial para. completar o diagnóstico da doença. No entanto, o sequenciamento não está incluso nos critérios de diagnóstico e nem disponível a todos os pacientes com EBDR, uma vez que a variabilidade das mutações dificulta a análise deste gene muito grande por técnicas simples e baratas. Através do sequenciamento do gene COL 7AI pela técnica de NGS (next generation sequencing) foram identificadas as mutações eri126 pacientes, sendo que 22 pacientes tiveram o diagnóstico de EBDR. Houve a identificação de 6 novas mutações ainda não descritas na literatura (c.8047-1 G>A, c.1758_I758delC, c.2783_2784insGACAC, c.2903C>T, c.3649G>A e c.8I9IG>T), sendo que duas delas foram vistas em mais de um alelo do gene (c.1758_1758deIC, c.2783_2784insGACAC). A mutação mais frequente nos pacientes,e com maior frequência alélica (25%) foi a mutação c.5047 C>T. Dez pacientes apresentaram mutações homozigóticas e nove são resultantes de casamentos consanguíneos. As mutações em sítio de splice c. 8304+ I G>A e c.8047-I G>A foram identificadas pelo sequenciamento dos íntrons, e podem ser alvo de terapias como éxon skiping ou edição genômica, em vez da inserção do gene COL7AI inteiro, um processo mais trabalhoso. Como os pacientes com EBDR sofrem exclusivamente da deficiência do colágeno VII, macrófagos foram modificados para expressar o gene COL 7AI sob o controle de promotores específicos sintético - o promotor Scavenger. Pensando em um protocolo clinico no futuro, o sistema não-viral Sleeping Beauty foi usado para integração do gene. Inicialmente a nucleofecção foi testada em células-tronco hematopoiéticas de camundongos (CTH) e macrófagos primários (PMM). In vitro vimos uma alta expressão de colágeno VII após a transfecção do vetor pT2-SP-Col7 nas células HEK293T e nos PMM, mas as CTH não permaneceram viáveis após a nucleofecção. Para os experimentos in vivo nos animais nocaute para o gene COL7AI (camundongo Col7AI -/-), os PMM foram nucleofectados com pT2-SP-Col7e pCMV-SBIOOX (expressa o Sleeping Beauty) e marcados com CM-Dil. Foi realizada a injeção intradérmica e intraperitoneal em am ongos neonatos Col AI -1-. Houve um aumento na sobrevida dos animais tratados que variou de 7 a 21 dias dependendo do tipo de tratamento. Nenhum dos animais apresentou lesões ou bolhas durante o período de avaliação, e possuíam tamanho e peso correspondente à metade do camundongo WT. Os PMM injetados foram localizadas na pele e o colágeno VII humano foi visto intracelularmente e na matriz extracelular. No camundongo que recebeu as células via intraperitoneal, a expressão e colágeno VII e os macrófagos foram vistos no baço, intestino e pele, indicando que houve migração dos PMM para a pele. Logo, a terapia com macrófagos expressando colágeno VII mostrou-se bastante promissora no aumento da sobrevi da dos animais Col7 AI -/- tratàdos.