Caracterização fenotípica e molecular de isolados de Acinetobacter spp. Produtores de oxa-carbapenemases provenientes de diferentes reservatórios

Abstract

The genus Acinetobacter comprises a set of bacterial species capable of causing infections in both humans and animals. High rates of carbapenem resistance have been reported among Acinetobacter spp. from worldwide, usually due to the production of carbapenemases. We evaluated isolates of Acinetobacter spp. producers of CHDL recovered from different reservoirs (human and animal). The Acinetobacter spp. isolated from birds were obtained from a surveillance study performed in collaboration with the São Paulo Zoo. Choanal and cloacal swabs from Anseriformes birds (captive and migratory) recovered at the São Paulo Zoo lake (Attachment 3). Subsequently, a microbiological screening was performed to select gram-negative bacilli with reduced sensitivity to carbapenems (Attachment 4). Those identified by MALDI-TOF MS as Acinetobacter spp. were selected. The results of this study were presented in two manuscripts: Article 1 - Published in November 2017 in the journal Antimicrobial Agents and Chemotherapy (Impact Factor: 4,302). The OXA-58-producing A. seiferttii AC12.1 isolate was recovered from the C. melancoryphus microbiota. The isolate showed high MICs for most β-lactams, amikacin, and polymyxin B. The quinolones, tigecycline, gentamicin, minocycline, and sulfamethoxazole/trimethoprim showed good in vitro activity against this isolate. AC12.1 showed a PFGE pattern and a plasmid profile identical to that of isolate previously identified from a patient diagnosed with bloodstream infection in the 1990s. In both bacterial isolates, a ~59 Kb plasmid was detected carrying blaOXA-58 gene, which has been not transferred by electroporation assays. Isolate AC12.1 was subjected to genetic analysis by walking sequencing and revealed that an ISAba825 was inserted upstream of blaOXA-58. Both structures were flanked by two copies of truncated ISAba3. Article 2 - Not submitted yet. The objective was to characterize isolates of OXA-72 producing A. baumannii recovered from captive and migratory Anseriformes from São Paulo Zoo. Additionally, we compare clinical isolates recovered from patients hospitalized at Hospital São Paulo between 2000 and 2017. All isolates were highly resistant to carbapenems and showed high MICs for other β-lactams. In contrast, all isolates showed low MICs for polymyxin B, minocycline, and tigecycline. Two clonal patterns were determined by PFGE (A and B). The pattern A was composed by human and Anseriformes isolates, and pattern B was composed exclusively by human isolates. According to the clonal pattern, distinct subtypes of both groups were selected for MLST (PubMLST) experiments. Clonal complex 79 was the most frequent one observed. All isolates carried a ~16 Kb plasmid with, which was transferred to ATCC19606 by electroporation. The plasmid location of blaOXA-72 was confirmed. Two representative isolates that showed the same genetic characteristics; however, recovered from different reservoirs were selected for whole genome sequencing by the Illumina MiSeq. Analyzes demonstrate that both isolates had the same 16,673 bp plasmid called pAC1-BRL. In addition to blaOXA-72, a macrolide resistance gene was detected, both flanked by the XerC / XerD recombination sites. Comparison with genetically related plasmids showed that pAC1-BRL is related to plasmids detected from different countries encoding different OXAs-carbapenemases. Interestingly, some plasmids considered genetically related did not carry CHDL-encoding genes. We conclude that the results presented in this dissertation expose information about the relationship of birds present in the FPZSP with the dissemination of microorganisms of clinical importance. This relation elucidates important genetic characteristics in these isolates and evidence a possible network of contamination / dissemination among different environments.

O gênero Acinetobacter compreende espécies bacterianas capazes de causar infecções tanto em humanos quanto em animais. Dentre este grupo algumas espécies se destacam mundialmente devido à alta taxa de resistência aos carbapenêmicos. Nesse estudo, avaliamos e comparamos isolados de Acinetobacter spp. produtores de carbapenemases do tipo OXA recuperados de diferentes reservatórios (humano e animal). Para os micro-organismos de fonte animal, foi realizado uma seleção em amostras coanais e cloacais previamente coletados de Anseriformes cativos e migratórios da FPZSP (Anexo 3 e 4). Nesta seleção, isolados bacterianos que apresentaram sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos e identificados como Acinetobacter spp. foram selecionados para as próximas etapas. Os resultados obtidos deram origem a dois artigos científicos. Artigo 1 - Teve o objetivo de reportar um isolado de Acinetobacter seiferttii (AC12.1) produtor de OXA-58 recuperado da microbiota do Anseriforme Cygnus melancoryphus. O perfil de sensibilidade apontou que as quinolonas, a tigecilina, a gentamicina, a minociclina e o sulfametoxazol/trimetroprim foram os antimicrobianos que apresentaram melhor atividade in vitro frente a esse isolado. Por outro lado, o isolado AC12.1 apresentou CIMs elevadas para a maioria dos beta-lactâmicos, amicacina e polimixina B. Adicionalmente, foi realizado a comparação do isolado AC12.1 com um isolado clínico de mesma espécie recuperado há mais de 20 anos. Além de apresentar perfil de sensibilidade semelhante e alta similaridade genética visto pela técnica de PFGE, ambos carreavam um plasmídeo de ~59 Kb que abrigava o gene blaOXA-58. A análise do contexto genético por walking sequencing revelou a presença de uma ISAba825 a montante da blaOXA-58. Ambas estruturas foram flanqueadas por duas cópias de ISAba3 truncadas. Artigo 2 - Neste estudo realizamos a comparação de isolados de Acinetobacter baumannii recuperados de fonte animal e humana produtores de OXA-72. Os isolados humanos foram provenientes de pacientes hospitalizados no Hospital São Paulo entre 2000 e 2017. Todos isolados apresentaram alta resistência aos carbapenêmicos e CIMs altas para os outros beta-lactâmicos. Entretanto, apresentaram CIMs baixas para polimixina B, minocilina e tigeciclina. Esses isolados apresentavam perfis distintos pela técnica de PFGE (A e B). O grupo clonal A mostrou-se mais heterogêneo, composto por isolados humanos e animais. Já o grupo B agrupava exclusivamente isolados humanos. De acordo com esse perfil clonal, amostras representativas foram selecionadas e submetidas à análise de MLST. Essa análise filogenética revelou a presença do complexo clonal 79 entre todos os isolados dos grupos A e B. Todos os isolados analisados apresentaram em comum um plasmídeo de ~16 Kb que foi passível de transferência para ATCC19606 por transformação. Neste plasmídeo foi confirmada a presença do gene blaOXA-72. Dois isolados representativos que compartilhavam as mesmas características genéticas, entretanto recuperados de diferentes reservatórios, foram selecionados para sequenciamento do genoma completo pelo Illumina MiSeq. As análises demonstraram que ambos isolados apresentavam o mesmo plasmídeo de 16.673 pb denominado pAC1-BRL. Neste plasmídeo, além da blaOXA-72 foram observados genes de resistência aos macrolídeos, ambos flanqueados pelos sítios de recombinação homóloga XerC/XerD. A comparação com plasmídeos geneticamente similares, demostrou uma relação do pAC1-BRL com plasmídeos de diferentes países. Interessantemente, alguns desses plasmídeos não abrigavam nenhuma OXA-carbapenemase. Concluímos que os resultados apresentados nessa dissertação, expõe informações sobre a relação de aves presentes na FPZSP com a disseminação de micro-organismos de importância clínica. Estes resultados também elucidaram características genéticas importantes nesses isolados evidenciando uma possível rede de contaminação/disseminação entre diferentes ambientes.