Avaliação dos mecanismos envolvidos nas ações antitumorais do extrato etanólico de Artemisia vulgaris

Abstract

Artemisia vulgaris (AV) is a species of the genus Artemisia with an ancient history. This herb is known for having a wide content of bioactive compounds that exert anti-hypertensive, hepatoprotective, antispasmodic, antiseptic, anti-inflammatory, immunomodulatory, antimalarial, antioxidant and anti-tumor activities. In this study, we evaluated the cytotoxic action of AV extract on breast cancer cells (MCF-7 and SK-BR-3) and chronic myeloid leukemia (K562), in addition to a comparison with the murine fibroblast (3T3). Cell viability studies in MCF-7 cells treated with artemisinin showed an increase in their viability, while treated with the ethanolic extract of AV for 24 hours, showed a decrease of their viability. The cell viability of the tumor cells (K562 and SKBR) was also decreased in the presence of the AV extract. On the other hand, this extract was less cytotoxic in non-tumor 3T3 cells. By using AnnexinV-FITC/7AAD staining on K562 cells it was demonstrated that AV induced cell death by late apoptosis and necrosis. We also found that the pretreatment of K562 cells with Necrostatin-1 (inhibitor of the necroptosis pathway) and with Ferrostatin-1 (inhibitor of the ferroptosis pathway) increased the viability of these cells in relation to treatment with AV extract alone. In an attempt to identify the main trigger of the death process in K562 cells, their intracellular calcium levels were measured by Fura2-AM under a fluorescence microscope. These tests were also carried out on 3T3 fibroblasts. We observed a Ca2+ mobilization in both cell lines treated with AV in the presence of these ions in the extracellular medium, with a lesser mobilization observed in the 3T3 fibroblasts. However, using zero calcium buffer, we observed a mobilization of calcium only in the K562 cells. These results signaled that the AV extract would be mobilizing the intracellular stocks of Ca2+ only in the tumor cells. Thus, using bafilomycin-A1 (BafA1,) which depletes the stocks of lysosomal calcium, we verified in K562 cells pre-treated with AV a depletion of stocks of lysosomal calcium, since when adding to BafA1 there was no response as for the mobilization of calcium, in contrast to the untreated cells, which responded to the addition of BafA1 with mobilization of lysosomal calcium. In order to observe whether the mobilized Ca2+ would be involved with cell death, we pretreated the K562 cells with BAPTA-AM and the AV extract. In this experiment, the viability of K562 cells was increased when pretreated with the chelator. Thus, we conclude that the extract evaluated here has cytotoxic activity because it activates several modalities of cell death, which are, in part, dependent on the mobilization of lysosomal calcium. New tests evaluating the lysosomal properties of this extract are of importance aiming at the development and pharmacological use of AV and its derivatives in antitumor therapy. In this context, the extract's ability to induce ferroptosis, a modality of death that has been pointed out as crucial in anticancer therapy, stands out.

A Artemisia vulgaris (AV) é uma espécie do gênero Artemisia com uma história milenar. Esta erva é conhecida por apresentar um amplo conteúdo de compostos bioativos que exercem atividades anti-hipertensivas, hepatoprotetoras, antiespasmódicas, antissépticas, anti-inflamatórias, imunomoduladoras, antimaláricas, antioxidantes e antitumorais. Neste estudo, avaliamos a ação citotóxica do extrato hidroalcoólico de Artemisia vulgaris (EHAV) em células de câncer de mama (MCF-7 e SK-BR-3) e de leucemia mieloide crônica (K562), comparando com uma linhagem não tumoral (NIH/3T3). Os estudos de viabilidade celular em células MCF-7 tratadas com a artemisinina mostraram um aumento na viabilidade, enquanto o tratamento com o EHAV por 24 horas, diminuiu sua viabilidade. A viabilidade celular das linhagens tumorais (K562 e SK-BR-3) foi diminuída também com o tratamento com o EHAV. Por outro lado, este extrato foi menos citotóxico em células não tumorais 3T3. A marcação com anexina V-FITC/7AAD em células K562 demonstrou que o EHAV induziu a morte celular por apoptose tardia e necrose. Verificamos também que o pré-tratamento das células K562 com o Necrostatin-1 (inibidor da via da necroptose) e com o Ferrostatin-1 (inibidor da via da ferroptose) aumentou a viabilidade destas células em relação ao tratamento com o EHAV, apenas. Os níveis de cálcio citosólico das células K52 e 3T3 foram medidos a fim de identificar o gatilho principal do processo de morte celular. Observamos que a mobilização de Ca2+ na linhagem 3T3 é menor que na linhagem K562, sugerindo uma ação seletiva do extrato na linhagem tumoral. Assim, utilizando a bafilomicina-A1 (BafA1,) para depletar os estoques de cálcio lisossomal, verificamos em células K562 pré-tratadas com EHAV uma depleção de estoques de cálcio lisossomal, uma vez que ao adicionarmos a BafA1 não houve resposta quanto a mobilização de cálcio, diferentemente das células não tratadas com o EHAV, que responderam a adição de Baf-A1 com mobilização de cálcio lisossomal. Ainda, a fim de observar se o Ca2+ mobilizado estaria envolvido com a morte celular, utilizamos o quelante de cálcio (BAPTA-AM) e o tratamento com EHAV, mostrando que o íon está influenciando na ativação de vias de morte, uma vez que neste ensaio a viabilidade das células K562 foi aumentada. Assim, concluímos que o extrato aqui avaliado possui atividade citotóxica por ativar várias modalidades de morte celular, as quais são, em parte, dependentes da mobilização de cálcio lisossomal. Novos ensaios avaliando as propriedades lisossomais deste extrato são de suma importância visando o desenvolvimento e uso farmacológico de AV e seus derivados na terapia antitumoral. Destaca-se neste contexto a capacidade do extrato em induzir ferroptose, uma modalidade de morte que vem sendo apontada como crucial na terapia anticancerígena.