Aplicação de isoforma de lacase purificada de meio de cultura do fungo endofítico xylaria sp. para promoção de crosslinking in vitro em córneas de abatedouro

Abstract

O ceratocone é uma doença corneana progressiva, bilateral e assimétrica, caracterizada por afinamento estromal e subsequente ectasia da córnea central e paracentral, com protrusão cônica, que provoca astigmatismos irregulares e miopia e proporciona baixa acuidade visual. As alterações visuais decorrentes desta ectasia podem ser controladas de diferentes formas, a depender da sua progressão. Neste contexto, o corneal crosslinking (CXL) permite estabilizar a progressão do ceratocone em córneas onde não há afinamento severo, utilizando a riboflavina como fotossensibilizador, seguida de exposição à luz ultravioleta A (UVA), para melhorar a estabilidade biomecânica e a resistência enzimática da córnea, retardando ou interrompendo a progressão da condição através da indução de ligações cruzadas no estroma. Entretanto, alguns estudos têm associado diversas complicações ao método convencional de CXL, tais como a perda e polimorfismos de queratócitos, perda de células endoteliais, com danos estruturais e funcionais persistentes, opacificações e perfurações de córnea, achatamento e ceratite secundária. Portanto, métodos alternativos para a obtenção de ligações cruzadas no estroma devem ser considerados, como por exemplo através de oxidorredutases, enzimas que catalisam reações de oxi-redução formando ligações cruzadas covalentes em proteínas, como o colágeno. Neste contexto, a enzima lacase surge como um composto natural com atividade potencial para a promoção de ligações cruzadas em córneas, apresentando, ao mesmo tempo, efeito citotóxico muito reduzido, e portanto, maior viabilidade de aplicação. Dessa forma, no presente estudo, obteve-se a enzima lacase por fermentação do fungo endofítico Xylaria sp., seguida de sua purificação e aplicação em crosslinking in vitro de córneas de porco de abatedouro. As córneas foram, então, caracterizadas por resistência à degradação enzimática e perfil de desnaturação térmica por calorimetria exploratória diferencial (DSC) para avaliar o potencial da lacase como um método alternativo ao CXL tradicional. Nossos resultados demonstram que o uso da enzima lacase em combinação com uma molécula fenólica, a catequina, possui grande potencial na formação de ligações cruzadas in vitro, reduzindo a taxa de degradação enzimática por colagenase e aumentando a temperatura de desnaturação em ensaios de DSC. Isoladamente, a lacase produzida pelo fungo endofítico Xylaria sp., quando comparada à comercial (Sigma-Aldrich), vii possui atividade de reticulação inferior. Entretanto, a combinação das lacases e catequina, apresentou níveis similares de atividade, sem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos, demonstrando que a enzima produzida em nosso projeto é igualmente funcional à comercial, quando utilizadas concomitantemente à catequina, e que possui potencial considerável na promoção de ligações cruzadas no estroma, sendo uma alternativa interessante ao método de CXL.