PIBIC CNPq (IC)O inibidor de tripsina de semente de tamarindo (ITT) é reconhecido por apresentar efeitos sacietogênicos, anti-inflamatórios e de redução na hiperglicêmica, além de potencial ação antimicrobiana in silico. Este estudo teve como objetivo testar in silico a interação do ITT teórico [modelo número 56, na conformação número 287 (ITTp 56/287)] com lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) e seu efeito in vitro sobre bactérias gram-negativas. Inicialmente o ITTp 56/287 foi avaliado por docking molecular quanto à interação com LPS de E. coli (PDB ID 4NHR) e Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium LT2 (PDB ID 4N4R). Posteriormente, seguiu-se com a obtenção e caracterização do ITT a partir da extração em tampão Tris-HCl, pH 7,5, saturações nas faixas de 0-30% (F1) e 30-60% (F2) com sulfato de amônio e isolamento do ITT por cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose 4B. O ITT foi caracterizado por meio da estimativa da massa molecular, da quantificação proteica, da determinação de atividade antitríptica e teste microbiológico contra E. coli e Salmonella spp. por meio do teste de microdiluição em caldo. Em relação aos resultados, a fração 2 (30 a 60%) apresentou a maior atividade antitríptica, com 72,40%. O ITT isolado obteve 97,59% (1.797,22 UI/mg) de atividade antitríptica, 0,018 mg/mL de proteinas e bandas proteicas com massa molecular de aproximadamente 20kDa. In silico, foi verificado a interação do ITTp 56/287 com LPSs teóricos de E. coli (PDB ID 4NHR) e Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium LT2 (PDB ID 4N4R) com docking score de -214,42 e -348,66, respectivamente. Entretanto, o efeito antimicrobiano do ITT não foi relevante em concentrações inferiores a 1 mg/mL contra E. coli e Salmonella spp. Tais resultados mostram a necessidade de mais pesquisas in vitro, considerando outras espécies bacterianas e ainda direcionadas à prospecção de peptídeos antimicrobianos derivados do ITT.