doctoralThesis
Avaliação da atividade antioxidante de quitosana extraída de fungos e de seu derivado conjugado com ácido gálico através de testes in vitro e in vivo utilizando modelo zebrafish (Danio rerio)
Registro en:
PAIVA, Weslley de Souza. Avaliação da atividade antioxidante de quitosana extraída de fungos e de seu derivado conjugado com ácido gálico através de testes in vitro e in vivo utilizando modelo zebrafish (Danio rerio). 2022. Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha. 82f. Tese (Doutorado em Biotecnologia) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2022.
Autor
Paiva, Weslley de Souza
Resumen
Oxidative stress is a cause of numerous diseases in humans, this causes a constant search for
new molecules that may have antioxidant capacity and prevent the emergence of diseases.
The objective of this work was to extract chitosan from fungi (Chit-F) and synthesize a new
molecule, conjugating it with gallic acid, which was called Chit-FGal, in order to potentiate
its antioxidant action. After collection, isolation and identification of the fungus as being of
the species Rhizopus arrhizus, it was possible to extract chitosan and after physical-chemical
tests such as high performance liquid chromatography (HPLC), Fourier transform infrared
(FTIR) and nuclear magnetic resonance (NMR) ), it was confirmed that the sample was
chitosan, with a degree of deacetylation of 86% and low molecular weight, in addition,
without the presence of proteins and phenolic compounds. After that, the synthesis of fungal
chitosan + AG (Chit-FGal) was successfully performed, confirmed by the 4x increase in the
amount of phenolic compounds in relation to Chit-F, as well as the appearance of a peak in
the region of the aromatic rings in the NMR analysis. When the 2 samples were
extracted/synthesized and characterized, the in vitro antioxidant tests were performed (Copper
Chelation, Iron Chelation, Total Antioxidant Capacity (CAT), reducing power and superoxide
radical scavenging), where the samples had activities in all the tests, however Chit-FGal
obtained results at least 50% (p <0.05) higher, demonstrating the potentiation of activities
when modifying the native molecule. When testing Chit-F and Chit-FGal in fibroblast cells
(NIH/3T3), there was no decrease in cell viability measured by MTT ((3-(4,5-
Dimethylthiazolyl- 2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) in any sample. , in addition, a
protection test against damage caused by hydrogen peroxide was performed, where ChitFGal at a concentration of 0.05 mg/mL showed better protection. A protective effect of embryos against damage caused
by 0.06 mM hydrogen peroxide (100% live embryos). Subsequently, 3 days after fertilization,
regarding the production of reactive oxigen species (ROS), lipid peroxidation and cell death
apoptotic rate of larvae treated with Chi-F and Chit-FGal post. In both protection rates against
the 3 surveys. These results combine the excellent potential antioxidant of Chit-FGal, as well
as this new molecule as a potential to treat various oxidative stress problems. O estresse oxidativo é uma causa de inúmeras doenças em humanos, isso provoca uma busca
constante de novas moléculas que possam ter capacidade antioxidante e evitar o surgimento
de doenças. O objetivo desse trabalho foi extrair quitosana de fungos (Chit-F) e sintetizar
uma nova molécula, conjugando Chit-F com ácido gálico, a qual foi denominada de ChitFGal, a fim de potencializar sua ação antioxidante. Após coleta, isolamento e identificação do
fungo como sendo da espécie Rhizopus arrhizus, foi possível extraír uma molécula que, após
testes físico- químicos como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), infravermelho
por transformada de fourier (FTIR) e ressonância magnética nuclear (RMN), foi caracterizada
como uma quitosana, com grau de desacetilação 86% e baixa massa molecular, além disso,
sem presença de proteínas e compostos fenólicos. Após isso, foi realizada com sucesso a
síntese de quitosana fúngica + AG (Chit-FGal), comprovada pelo aumento em 4x da
quantidade de compostos fenólicos em relação a Chit-F, como também o surgimento de um
pico na região dos anéis aromáticos na análise de RMN. Ao ter as 2 amostras
extraídas/sintetizadas e caracterizadas, foram realizados os testes antioxidantes in vitro
(Quelação de cobre, quelação de ferro, capacidade antioxidante total (CAT), poder redutor e
sequestro de radical superóxido), onde as amostras tiveram atividades em todos os testes,
porém Chit-FGal obteve resultados pelo menos 50% (p <0,05) superiores, demonstrando a
potencialização das atividades ao modificar a molécula nativa. As amostras Chit-F e ChitFGal não foram citotóxicas para fibroblastos murinos (NIH/3T3) em nenhuma das
concentrações utilizadas. Quando estas células foram expostas a apenas peróxido de
hidrogênio (0.06 mM), detectou-se sinais de citotoxicidade que não abolidos quando estas
células foram expostas a peróxido de hidrogênio e Chit-Fgal (de 0,05 a 0,25 mg/mL). Ao
testar a capacidade antioxidante in vivo utilizando modelo zebrafish (Danio rerio), foi
observado um efeito de proteção dos embriões contra danos causados por peróxido de
hidrogênio 0,06 mM. Posteriormente as larvas com 3 dias pós fecundação foram analisadas
quanto a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), peroxidação lipídica e a taxa de
morte celular por apoptose . Ambas demonstraram ação protetora contras os 3 fenômenos
estudadas. Esses resultados demonstram o excelente potencial antioxidante de Chit-F, como
também a potencialização dessa ação ao conjugar esse polímero com ácido gálico (ChitFGal), in vitro e in vivo o que torna essa nova molécula como promissora como antioxidante, com potencial para tratar diversos problemas causados pelo estresse oxidativo.