Dissertação
Avaliação da redução da concentração do soro fetal bovino na expressão de proteínas envolvidas na diferenciação neuronal nas linhagens SH-SY5Y, Neuro2a e PC12
Registro en:
SANTOS, Mônica Garcia dos. Avaliação da redução da concentração do soro fetal bovino na expressão de proteínas envolvidas na diferenciação neuronal nas linhagens SH-SY5Y, Neuro2a e PC12. 2021. Dissertação (Mestrado em Ciências Biomédicas) - Universidade Estadual de Ponta Grossa. Ponta Grossa. 2021.
Autor
Santos, Mônica Garcia dos
Institución
Resumen
Cell differentiation to neurons involves neuritogenesis, i. e., neurites formation.
Neurites are protrusions of soma that become dendrites and axons. When this change
occurs, cell promotes synapses, establishing neuronal connections. In vitro studies,
there are differentiation protocols using neurotrophic factors and/or retinoic acid under
fetal bovine serum (FBS) concentration reduction that differ normal condictions.
However, the role of FBS reduction still needs to be defined. The aim of this study was
to test whether only reduction of 10% to 1% or 0% FBS could alter proteins expression,
likewise established protocols already alter. Synaptophysin, protein of synaptic
vesicles, was used as classic neuronal marker. This study also analyzed cellular príon
protein (PrPc
) and stress inducible protein 1 (STI1) as possible neuronal markers. For
this, human neuroblastoma (SH-SY5Y), murine neuroblastoma (Neuro2a) and rat
pheochromocytoma (PC12) cell lines were cultived under normal conditions with 10%
FBS, FBS reduction conditions of 1% and 0% and differentiation conditions using
retinoic acid (RA) for neuroblastomas and nerve growth fator (NGF) for
pheochromocytoma. After differentiation time, cells were processed to obtain extracts,
which were analized by western blot, using following antibodies: antisynaptophysin,
anti-PrPc
, anti-STI1 and anti-actin. In SH-SY5Y cells experiments, synaptophysin was
not detected by antibody anti-synaptophisin, indicating there was no protein
expression. PrPc protein presented conflicting results and it was not possible to say its
involvement in differentiation. Neuro2a cell line presented higher expression of
synaptophysin and PrPc
in group maintained at 1% FBS for 3 days in relation to the
10% FBS group, both in FBS reduction assay, and in RA differentiation assay, showing
to be independent of RA. In FBS reduction assay, PC12 cells maintained at 0% FBS
showed an increase in the expression of synaptophysin and PrPc proteins in relation
to 10% FBS group. In differentiation assay of PC12 cell line, it was possible to observe
increase of synaptophysin expression in groups 1% FBS in relation to group 10% FBS,
even without NGF, and it was shown to be time dependent. However, groups 1% FBS
did not present an increase in PrPc expression in relation to group 10% FBS. Regarding
STI1 protein, it was not possible to observe differences of expression between
conditions, neither in cell lines. In conclusion, serum reduction can be sufficient to
induce differentiation in studies with PC12 maintained to 0% FBS and in Neuro2a cells
under FBS reduction conditions, maintained to 1% FBS, using synaptophysin as neural
marker and possibly PrPc as a new marker. O processo de diferenciação celular nos neurônios envolve a neuritogênese, que é a
formação de neuritos. Os neuritos são projeções do corpo celular que se transformam
em dendritos e axônios. Quando essa mudança ocorre, a célula promove as sinapses,
intercomunicando-se com as outras ao seu redor. Nos estudos in vitro, existem
protocolos de diferenciação que usam fatores neurotróficos e/ou ácido retinóico,
combinados com soro fetal bovino (SFB) em concentrações menores das usadas para
manutenção celular. Entretanto, o papel da redução do SFB ainda precisa ser definido.
Neste estudo, o objetivo foi avaliar se apenas a redução de 10% para 1% ou 0% SFB
poderia alterar a expressão de proteínas envolvidas na diferenciação neuronal, da
mesma forma que os protocolos já estabelecidos alteram. A proteína sinaptofisina,
presente na membrana de vesículas sinápticas, foi utilizada por ser um marcador
neuronal clássico. Este estudo também analisou a proteína príon celular (PrPc
) e a
proteína induzida por estresse 1 (STI1) como possíveis marcadores neuronais. Para
isso, linhagens celulares de neuroblastoma humano (SH-SY5Y), neuroblastoma
murino (Neuro2a) e feocromocitoma de rato (PC12) foram cultivadas em condições
normais de manutenção com 10% SFB, em condições de redução de SFB a 1% e 0%
e em condições de diferenciação usando ácido retinóico (AR) para os neuroblastomas
e fator de crescimento de nervo (NGF) para feocromocitoma. Após os tempos de
diferenciação, as células foram processadas para obtenção dos extratos, que foram
analisados por western blot, usando os seguintes anticorpos: anti- sinaptofisina,
antiPrPc
, anti-STI1 e anti-actina. Nos experimentos com as células SH-SY5Y, a
proteína sinaptofisina não foi detectada pelo anticorpo anti-sinaptofisina, indicando
que não houve expressão desta proteína. Já a proteína PrPc apresentou resultados
conflitantes, não sendo possível afirmar que sua expressão esteja envolvida na
diferenciação. A linhagem Neuro2a apresentou maior expressão de sinaptofisina e de
PrPc no grupo mantido a 1% SFB por 3 dias em relação ao grupo 10% SFB, tanto no
ensaio de redução de SFB, como no ensaio de diferenciação com AR, mostrando-se
independente de AR. No ensaio de redução de SFB, as células PC12 mantidas a 0%
SFB apresentaram aumento na expressão das proteínas sinaptofisina e PrPc em
relação ao grupo 10% SFB. No ensaio de diferenciação da linhagem PC12, foi
possível observar o aumento de expressão de sinaptofisina nos grupos 1% SFB em
relação ao grupo 10% SFB, mesmo sem NGF, e mostrou-se dependente de tempo.
Porém, os grupos 1% SFB não apresentaram aumento na expressão de PrPc em
relação ao grupo 10% SFB. Quanto à proteína STI1, não foi possível observar
diferenças de expressão entre as condições, em nenhuma das linhagens. Conclui-se
que, a redução de soro pode ser suficiente para indução da diferenciação nos estudos
com PC12 mantidas a 0% SFB e em células Neuro2a nas condições de redução de
SFB, mantidas a 1% SFB, utilizando como marcador neuronal sinaptofisina e,
possivelmente, PrPc como novo marcador.