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Identification of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis by PCR techniques and establishment of control programs for bovine paratuberculosis in dairy herds
Identificación de mycobacterium avium subspecies paratuberculosis mediante pruebas de PCR y definición de programa de control de la paratuberculosis bovina en hatos lecheros
Registro en:
Zapata Restrepo MM, Arroyave Henao O, Ramírez García R, Piedrahita Ochoa CA, Rodas González JD, Maldonado Estrada JG. Identification of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis by PCR techniques and establishment of control programs for bovine paratuberculosis in dairy herds. Rev. Colomb. Cienc. Pecu. 2010;23(1):17-27
0120-0690
2256-2958
Autor
Zapata Restrepo, Margarita María
Arroyave Henao, Ofelia
Ramírez García, René
Piedrahita Ochoa, Christian Alberto
Rodas González, Juan David
Maldonado Estrada, Juan Guillermo
Institución
Resumen
ABSTRACT: The aim of this study was to establish the protocol of conventional and real time PCR for amplification
of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) genome from bovine fecal samples, as a way
to define strategies for establishing a prevention and control program in a dairy herd at the Universidad
de Antioquia (Medellín, Colombia). Fecal samples were individually taken of clinical healthy cows or
cows with diarrhea bred in a herd enzootic for Johne’s disease, were processed them for culture in liquid
Middlebrook 7H9 media supplemented with mycobactin under two different protocols: with or without
inhibitors. Fecal samples from clinically healthy cows were used as negative control. Conventional and
real time PCR were performed with MAP DNA obtained of fecal or cultured samples. The MAP- specific
IS900 segment was amplified by using the respective forward and reverse primers. DNA isolated from a
reference MAP strain was used as positive control of PCR. Data were analyzed by descriptive statistics
and simple regression analysis between PCR and culture results were performed. All samples cultured
in media with or without mycobactin gave a positive result compatible with MAP growth. However, only
13,3% of samples were positive by real time PCR. There was no relationship neither between PCR and culture results, nor between clinical condition of the cow and MAP positivity. These results support the
need combine culture of feces with PCR diagnosis for identification of MAP-excreting cows in a dairy
herd. Finally, a strategy of prevention and control of bovine paratuberculosis is proposed for this enzootic
herd and for dairy herds in Colombia. RESUMEN: El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de detección y amplificación del Mycobacterium
avium paratuberculosis (MAP) a partir de muestras de materia fecal bovina, mediante el uso de la técnica
de PCR en tiempo real, como estrategia de apoyo para el establecimiento de un programa de prevención
detección y control de la paratuberculosis bovina en el hato lechero de la Universidad de Antioquia. Muestras
de materia fecal fueron tomadas de bovinos provenientes de un hato enzoótico para la enfermedad de Johne,
fueron cultivadas en medio de cultivo líquido Middlebrook 7H9 suplementado con micobactina, bajo dos
protocolos de aislamiento: con o sin inhibidores. Como control negativo fue utilizada muestras de materia
fecal de bovinos clínicamente sanos. Adicionalmente, con el DNA de las muestras aisladas en cultivo y
de las muestras de materia fecal, fueron hechas pruebas de PCR convencional y en tiempo real, para la
amplificación del elemento de inserción IS900 del MAP, mediante el uso de cebadores específicos para este
elemento. Como control positivo se utilizó DNA de MAP de una cepa de referencia. Los resultados fueron
evaluados mediante estadística descriptiva y la comparación entre el resultado del cultivo y de la prueba
de PCR fue evaluado mediante regresión simple. Los resultados del cultivo bacteriológico, mostraron un
total de 15 muestras con crecimiento compatible con MAP, el cual fue verificado por prueba de PCR en
el 13.3% de los casos. No hubo correlación entre el resultado de cultivo y la prueba de PCR ni entre el
estado clínico y la positividad al MAP. Los resultados confirman la necesidad de combinar el diagnóstico
molecular con el cultivo bacteriológico para identificar las vacas positivas en un hato. Finalmente, una
estrategia de prevención y control de la enfermedad aplicable a este hato enzoótico y a los hatos lecheros
en Colombia es discutida. COL0001262