Identificación de una enzima involucrada en el metabolismo del NAD+ en Leishmania braziliensis, la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (LbNAPRT)

Abstract

La leishmaniasis es una enfermedad causada por el parásito protozoario del género Leishmania que, en países como Afganistán, Argentina, Colombia, Brasil, Irán, Siria, Etiopía, Sudan del norte, Costa Rica y Perú representan el 75 % del índice de prevalencia [1]. La Organización Mundial de la Salud (OMS) reportó un total de 1.5 millones de nuevos casos en 102 países incluyendo Colombia. En la actualidad los medicamentos utilizados para el tratamiento de esta parasitemia como los antimoniales pentavalentes causan diversos efectos secundarios por lo cual, es necesario identificar nuevos blancos farmacológicos efectivos [2]. De esta forma el metabolismo energético podría ser considerado relevante en la búsqueda de posibles dianas farmacológicas, ya que es esencial para el mantenimiento de la integridad celular del protozoario [3]. En este contexto la nicotinato fosfo-ribosil transferasa (NAPRT) es una proteína de interés, debido a que determina los niveles de NAD+ intracelular. La NAPRT es la proteína encargada de sintetizar el mononucleótido de ácido nicotínico (NAMN) a partir del ácido nicotínico (NA) y la 5-fosfo-α- D -ribosa 1-difosfato (PRPP), siendo esencial en la vía de Preiss-Handler al regular los niveles del NAD+ en el parásito. En este trabajo se identificó la NAPRT en Leishmania braziliensis (LbNAPRT). Al analizar la secuencia in silico se observaron características asociadas a la interacción con los sustratos, regiones de posible oligomerización y de regulación alostérica. El análisis experimental se llevó a cabo mediante la generación de la proteína recombinante (LbNAPRT6xHis) en el sistema heterólogo E.coli. Se partió de ADN genómico de promastigotes de L. braziliensis para amplificar la secuencia codificante y construir el vector recombinante pET-22b+LbNAPRT. La proteína obtenida se empleó para el estudio de su funcionalidad en ensayo enzimático directo. A partir de la producción de proteína recombinante en el sistema heterólogo de E.coli se generó una herramienta inmunológica en modelo aviar, contra la LbNAPRT6xHis. Adicionalmente se realizaron ensayos de western blot e inmunofluorescencia para determinar la localización intracelular de la proteína, la cual presenta una ubicación a nivel citoplasmático en el estadio promastigote del parásito. Los resultados obtenidos constituyen un paso importante en el metabolismo del NAD, ya que se logró identificar funcionalmente la nicotinato fosfo-ribosil transferasa de Leishmanian braziliensis, esencial para la síntesis de los precursores del NAD+, como la primera NAPRT en protozoarios de importancia en la salud pública. (Texto tomado de la fuente)

Leishmaniasis is a disease caused by the protozoan parasite of the genus Leishmania which, in countries such as Afghanistan, Argentina, Colombia, Brazil, Iran, Syria, Ethiopia, North Sudan, Costa Rica and Peru represent 75% of the prevalence rate [1]. The World Health Organization (WHO) reported a total of 1. 5 million new cases in 102 countries including Colombia. Currently, the drugs used for the treatment of this parasitaemia, such as pentavalent antimony drugs, cause various side effects, so it is necessary to identify new effective pharmacological targets [2]. In this way, the energy metabolism could be considered relevant in the search for possible pharmacological targets, since it is essential for the maintenance of the cellular integrity of the protozoan [3]. In this context, nicotinate phosphoribosyl transferase (NAPRT) is a protein of interest because it determines intracellular NAD levels. NAPRT is the protein responsible for synthesizing nicotinic acid mononucleotide (NAMN) from nicotinic acid (NA) and 5-phospho-α-D -ribose 1-diphosphate (PRPP), being essential in the Preiss-Handler pathway by regulating NAD+ levels in the parasite. In this study NAPRT was identified in Leishmania braziliensis (LbNAPRT). When analyzing the in silico sequence, characteristics associated with the interaction with the substrates, regions of possible oligomerization and allosteric regulation were observed. The experimental analysis was performed by generating the recombinant protein (LbNAPRT6xHis) in the heterologous E. coli system. Genomic DNA from promastigotes of L. braziliensis was used to amplify the coding sequence and construct the recombinant vector pET-22b+LbNAPRT. From the production of recombinant protein in the heterologous system of E. coli, an immunological tool against LbNAPRT6xHis was generated in an avian model. Additionally, western blot and immunofluorescence assays were performed to determine the intracellular localization of the protein, which is located at the cytoplasmic level in the promastigote stage of the parasite. The results obtained constitute an important step in NAD metabolism, since it was possible to functionally identify the nicotinate phosphor-ribosyl transferase of Leishmania braziliensis, essential for the synthesis of NAD+ precursors, as the first NAPRT in protozoa of public health importance.