Generación de sistemas CRISPR para estudiar vías de regulación de la expresión génica en Trypanosoma cruzi

Abstract

El siguiente trabajo final de carrera presenta el desarrollo y utilización de diferentes tecnologías de biología molecular y secuenciación masiva para estudiar las vías de regulación de la expresión génica del protozoo Trypanosoma cruzi (causante de la enfermedad de Chagas) implicadas en la expresión diferencial en los distintos estadíos del ciclo de vida del mismo. Para esto se analiza la metilación del retroelemento VIPER diferencialmente expresado utilizando la secuenciación Oxford Nanopore, con especial interés en los estadíos que infectan a los mamíferos. Mediante esta aproximación no fue posible definir un patrón de metilación que explique los perfiles de expresión. Se construyeron sistemas CRISPR/Cas con endonucleasas Cas alternativas que permiten el estudio de pequeños ARNs no codificantes como moléculas reguladoras de la expresión del elemento VIPER en T. cruzi. Algunos pequeños ARNs no codificantes fueron descritos como determinantes en la regulación de la expresión de elementos transponibles en otros organismos, por lo que se estudiará si VIPER puede estar siendo regulado por este mecanismo. Las herramientas CRISPR/Cas desarrolladas en este trabajo permiten caracterizar la interacción del elemento VIPER con un pequeño ARN no codificante previamente identificado en el laboratorio y con proteínas que participen en el proceso. Esto es mediante la inhibición de la transcripción de estos elementos por impedimento estérico (dCas9), la degradación del ARNm correspondiente al VIPER y/o al pequeño ARN no codificante (LwaCas13a) y la identificación de proteínas que interaccionan con estos ARNs a través de la adición de moléculas etiquetadoras de forma dirigida (dPspCas13b fusionada a APEX2).