| dc.description | La proteína quinasa CK2 es una enzima altamente conservada y presente en
todas las células eucariotas estudiadas hasta el momento. Fosforila, al menos in
vitro, más de 300 sustratos proteicos. Esto último la involucra en numerosos
procesos celulares tales como expresión génica, síntesis de proteínas,
transducción de señales, división celular, morfología celular, desarrollo y
apoptosis. A su vez, la proteína quinasa CK2 ha sido implicada en numerosas
patologías que incluyen cáncer, enfermedades infecciosas y neurodegeneración.
La holoenzima que ha sido purificada desde diferentes eucariotas es
generalmente un heterotetrámero compuesto por dos subunidades catalíticas
(CK2a y/o CK2a') y dos subunidades regulatorias (CK2í3). Las subunidades a y
a' son catalíticamente activas por si mismas. Por su parte, la subunidad
regulatona es inactiva pero estimula de 5 a 10 veces la actividad de la subunidad
catalítica frente a la mayoría de los sustratos. Esta quinasa fosforila serinas y
treoninas que se encuentran formando parte de secuencias acídicas, siendo su
secuencia consenso mínima S/T X X D/E. La proteína quinasa CK2 no responde
a ningún tipo de segundo mensajero, aunque puede ser estimulada por
poliaminas e inhibida por compuestos polianiónicos. Entre todas las quinasas la
proteína quinasa CK2 es inusual en el hecho de que puede emplear
eficientemente tanto ATP y GTP como dador de grupo fosforilo.
Numerosos estudios han detectado la presencia de la proteína quinasa CK2 en
el citoplasma y en el núcleo. A nivel subcitosólico se ha determinado la
presencia de CK2 en mitocondrias, unida a microtúbulos y asociada a la cara
externa del retículo endoplasmático. A su vez, son numerosos los trabajos que
demuestran la localización de la proteína quinasa CK2 en la superficie celular,
en cuyo caso podemos referirnos a CK2 como una ectoquinasa.
La presencia de CK2 como ectoquinasa cobra relevancia al haberse demostrado
su existencia en la superficie de una variada gama de tipos celulares, desde
linfocitos hasta neuronas. Estudios enfocados a determinar la relevancia
fisiológica de la proteína quinasa CK2 como ectoquinasa han sugerido su
participación en la adhesión y migración celular, en el efecto mitogénico de
uroquinasa y en la protección celular contra la lisis mediada por el sistema del
complemento.
Si bien los estudios llevados a cabo en el campo de CK2 como ectoquinasa son
de larga data, existen aspectos fundamentales aun desconocidos. Teniendo en
cuenta que ninguna de las subunidades de CK2 posee una secuencia con
características de péptido señal que le permita transitar por la vía clásica de
secreción de proteínas cabe preguntarse qué mecanismo permite la llegada de
CK2 a la superficie celular. A partir de esta incógnita surge la pregunta que
moviliza al presente trabajo, ¿qué secuencia o estructuras de CK2 son
requeridas para que tenga lugar su exportación al medio extracelular? La
respuesta a pregunta podría darnos las pautas necesarias para alcanzar una
respuesta satisfactoria a la primer incógnita.
La búsqueda de dicha secuencia o estructura enfrenta un primer obstáculo
consistente en la escasa cantidad de CK2 ectoquinasa que es posible recuperar
a partir de células en cultivo. Esta dificultad se superó mediante la
sobreexpresión, en células eucariota, de las subunidades recombinantes de
CK2. La subunidades ectópicas se produjeron con etiquetas que facilitaron su
seguimiento y aislamiento. A su vez, este modelo celular nos permitió expresar
diversas mutantes de ambas subunidades de CK2, con lo cual se llevó a cabo el
rastreo de las secuencias requeridas para la exportación de CK2.
En primer lugar pudimos demostrar que la subunidades catalíticas CK2a o
CK2a', por si solas, no son capaces de alcanzar el espacio extracelular y que
requieren formar parte del heterotetrámero para ser exportadas. Por otra parte,
se determinó que la actividad catalítica de CK2 no es precisada para que tenga
lugar la exportación, con lo que descartamos el requenmiento de sustratos
fosforilados por CK2 en dicho proceso.
En cuanto a la detección de actividad CK2 ectópica en la superficie celular a
diferentes horas postra nsfecci ón, se observó que ésta se encuentra desfasada
en 5 a 7 horas con respecto a la aparición intracelular de dicha actividad y que
tal proceso no precisa de la síntesis de novo de proteínas.
Se determinó que la actividad CK2 ectópica localizada en la superficie celular es
capaz de fosforilar vitronectina, sustrato fisiológico de CK2 presente en la matriz
extracelular. Dicha fosforilación fue sensible a la inhibición por heparina en el
caso de expresión de la quinasa silvestre pero resistente cuando se transfectó
una mutante parcialmente refractaria a tal compuesto.
Utilizando mutantes de deleción y sustitución de CK213 se encontró en esta
subunidad regulatoria una secuencia (20-33) importante para el proceso de
exportación de CK2. El estudio detallado de esta secuencia nos llevó a
demostrar la relevancia de las fenilalaninas 21 y 22 y de los aminoácidos
acidicos 26, 27 y 28 en la eficiencia del segmento 20-33 como señal de
exportación. Sin embargo, esta secuencia no puede considerarse como una
señal de exportación propiamente dicha, sino como una estructura de
exportación dependiente de su entorno molecular. Finalmente, se demostró que
la subunidad CK213 ectópica es exportada en forma aislada pero, a diferencia de
la holoenzima, no es retenida en la superficie celular. | |
