Tesis Doctorado
Los plasticidas bisfenol-a y nonilfenol inducen apoptosis de células germinales durante la espermatogénesis a través de un mecanismo dependiente de la adam17
Autor
Lagos-Cabré, Raúl Cristián
Institución
Resumen
Los xenoestrógenos son moléculas con actividad estrogénica y antiandrogénica,
que pueden interferir en procesos biológicos como la espermatogénesis, aumentando la
apoptosis de las células germinales. El bisfenol-A y el 4-nonilfenol son dos xenoestrógenos
que se encuentran abundantemente en el medio ambiente y que producen muerte de las
células germinales en los testículos de rata. Además, estos compuestos afectan
negativamente a los niveles hormonales y las características sexuales secundarias de los
animales y humanos, las que pueden ser heredadas a la progenie, demostrando, también,
que poseen efectos transgeneracionales.
La espermatogénesis es el proceso por el cual se generan los espermatozoides,
gametos masculinos, a partir de una célula diploide llamada espermatogonia y culmina con
la liberación de un espermatozoide especializado, haploide pero sin motilidad, la que se
adquiere en el epidídimo. Este proceso es especialmente sensible a los xenoestrógenos y
los efectos negativos de estos compuestos sobre la espermatogénesis han sido ampliamente
documentados. Sin embargo, sólo unos pocos artículos detallan algunos mecanismos que
pueden ser activados por dichos xenoestrógenos. El objetivo de esta tesis es determinar qué
mecanismos están involucrados en la muerte de las células germinales inducida por
xenoestrógenos. En este sentido, a partir de datos preliminares de nuestro laboratorio e
información publicada por otros grupos, proponemos que las proteínas de la familia
ADAM participan en los efectos negativos provocados por los xenoestrógenos.
Las proteínas ADAMs son metaloproteasas de la membrana celular, que tienen la
función de liberar los ectodominios de sustratos al medio externo desde la membrana plasmática y modificar la matriz extracelular. La actividad de algunos miembros de la
familia ADAM se relaciona con la muerte por apoptosis, que ocurre durante la
espermatogénesis, y es sabido que estas metaloproteasas son activadas por distintos
estímulos externos, como drogas, estrés oxidativo, proteínas quinasas y aumento de la
concentración de ion calcio intracelular ([Ca2+]i). El miembro más estudiado y ubicuo de
esta familia es la ADAM17, la cual está relacionada con la apoptosis de células germinales
activada con etopósido, una droga anti cancerígena.
Hemos probado que en el modelo utilizado (Rata) responde a los xenoestrógenos,
ya que aumentó la muerte de células germinales en testículos de rata de 21 días de edad,
que corresponde a ratas prepuberales, siendo un modelo excelente para el estudio del
efecto de los xenoestrógenos debido a que estos compuestos actúan en ciertas etapas del
desarrollo afectando de mayor manera el tracto reproductivo. Además, observamos que
aumentan las especies reactivas de oxígeno (ROSs) en testículos de rata tratadas con
xenoestrógenos, lo que concuerda con datos expuestos en la literatura. La inhibición
farmacológica de la ADAM17 previno significativamente la muerte inducida por estos
xenoestrógenos, sugiriendo que esta metaloproteasa participa en este mecanismo. Las
ROSs generadas por los xenoestrógenos pueden ser en parte responsables de la muerte
celular inducida por xenoestrógenos, ya que en células tratadas con antioxidantes la
apoptosis disminuye, al igual que lo observado con la inhibición de p38MAPK, la cual
reduce significativamente la muerte celular inducida por xenoestrógenos. Los niveles
proteicos de la ADAM17 no cambiaron en presencia de xenoestrógenos, sugiriendo que los
xenoestrógenos podrían actuar aumentando la actividad de la ADAM17. Para comprobar
esto, estudiamos la localización de la ADAM17 en la superficie celular, ya que es una
buena aproximación a la activación de esta metaloproteasa, debido a que sólo la ADAM17 activa se localiza en membrana. Observamos que efectivamente aumenta la localización de
la ADAM17 en la superficie de las células germinales aisladas, lo que fue dependiente de
la activación de p38MAPK
. Esta interpretación fue apoyada por resultados obtenidos en
células transfectadas con un sustrato de la ADAM17 acoplado a fosfatasa alcalina, lo que
permite estudiar de forma indirecta la actividad de la ADAM17, mediante la medición de
la actividad fosfatasa en el medio de cultivo. Los resultados fueron consistentes con los de
la ADAM17 en la superficie celular.
Para identificar el mecanismo que activa la ADAM17, propusimos estudiar si los
aumentos de la [Ca2+]i producido por los xenoestrógenos participan en la activación de la
ADAM17. Observamos que la ADAM17 responde al aumento de la [Ca2+]i inducido con
un ionóforo de Ca2+, y que la actividad de la ADAM17 disminuye en presencia de
quelantes de Ca2+ o del uso de una solución extracelular libre de Ca2+. Los xenoestrógenos
aumentan la [Ca2+]i por un mecanismo que puede involucrar ingreso de Ca2+
desde el
exterior o liberación de Ca2+ de reservorios intracelulares. Nuestros resultados muestran
que la ADAM17 responde al ingreso y no a la liberación de Ca2+ de reservorios internos.
Por esto, decidimos estudiar si este ingreso de Ca2+ podría estar mediado por hemicanales
formados por pannexinas, los que son permeables a Ca2+, por lo tanto podrían mediar
aumentos en la [Ca2+]i debido a que están acopladas a receptores P2X. La activación de la
ADAM17 inducida por xenoestrógenos no se relacionó con un aumento en la
permeabilidad de los hemicanales formados por pannexinas, debido a que los inhibidores
de estos no redujeron la actividad de la ADAM17 ni su localización en membrana. Aún
así, nuestros resultados avalan la participación de la ADAM17 como un nuevo miembro
del mecanismo de la muerte celular inducida por xenoestrógenos, un proceso dependiente
de la p38MAPK y estrés oxidativo. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Mención en Ciencias Fisiológicas 150p. PFCHA-Becas TERMINADA