El endotelio juega un apel fundamental en el control del tono vascular a través de la liberación de sustancias vasoactivas. El óxido nítrico (NO) es una ubicua molécula de señalización que emergió como el más importante vasodilatador derivado del endotelio. En el endotelio, el NO es sintetizado a partir de la L-arginina por la isoforma endotelial de la enzima dependiente de calcio -calmodulina conocida como la NO sintasa (eNOS). De esta manera, los vasodilatadores dependientes del endotelio activan a la eNOS a través de un aumento en la concentración del calcio intracelular (Ca 1 ). Sin embargo, también pueden inducir la producción de NO estímulos fTsicos, como la tensión de roce ejercida por el flujo de la sangre sobre la superficie endotelial. Se piensa que la liberación tónica de NO inducida por flujo participa en el control de la resistencia periférica, porque la inhibición de la NOS in vivo provoca un aumento de la presión sanguínea. La participación del calcio en la producción de NO en respuesta al flujo no es clara. Los cambios en la tensión de roce estimulan un aumento transitorio de la Ca que sólo podría explicar la producción de NO en una etapa inicial. Por lo tanto, en la producción sostenida de NO debería participar otro mecanismo. La eNOS presenta secuencias de consenso para la fosforilación por varias proteínas quinasas y la enzima se puede fosforilar en residuos ser, treonina y tirosina. La fosforilación de la eNOS podría ser un mecanismo de modulación rápida y persistente de la producción de NO que explique la activación sostenida de la enzima en respuesta a la tensión de roce. Además, la eNOS se encuentra principalmente en las caveolas de la membrana celular en una asociación inhibitoria con la caveolina- 1. Un aumento en la Ca ++ ¡ibera a la eNOS de la caveolina- 1 e induce la translocación de la enzima al citosol. Sin embargo, no está claro el significado funcional de los cambios en la distribución subcelular de la enzima y si la translocación de la eNOS participa en el ciclo activación-inactivación de la enzima en respuesta al flujo. Por otro lado, la pared vascular funciona coordinadamente gracias a la comunicación celular a traves de las uniones comunicantes. En cultivos de células endoteliales se observó que el flujo laminar induce un aumento en la Ca sólo en algunas células, lo que sugiere que las células endoteliales no detectan de igual forma este estímulo. Sin embargo, no se sabe si la comunicación celular participa en la producción de NO en respuesta a! flujo. Con estos antecedentes, en esta Tesis se formuló la hipótesis de trabajo que en las células endoteliales de la microcirculación: 1) La tensión de roce induce la activación de la eNOS a través de dos mecanismos independientes, un mecanismo inicial transitorio dependiente de calcio y otro sostenido asociado a cambios en el estado de fosforilación de la enzima. 2) El mecanismo dependiente de calcio se asocia con la translocación de la enzima desde la membrana al citosol. 3) La producción de NO depende de la comunicación entre las células endoteliales a Iravés de las uniones comunicantes Para abordar este problema nos propusimos estudiar los mecanismos de activación de la eNOS en respuesta al flujo en preparaciones de vasos de resistencia intactos y en la microcirculación in vivo. Con este fin nos planteamos los siguientes objetivos. 1.- Caracterizar la liberación de NO inducida por la tensión de roce. II.- Estudiar durante la producción de NO estimulada por flujo: la participación del calcio, la distribución subcelular de la eNOS y la fosforilación de la enzima. III.- Estudiar la participación del acoplamiento celular en la producción de NO inducida por flujo. Este trabajo se realizó usando las preparaciones de la red arterial mesentérica de rata perfundida aislada, arteriolai mesentéricas de rata perfiindidas aisladas y la microcirculación de la mejilla del hámster superfundida in vivo. En la red arterial mesentérica y en la mejilla de hámster se detectó la producción de NO por el método de la quimioluminiscencia y se analizaron los cambios en la eNOS por fraccionamiento subcelular, inmunoprecipitación e inmunotransferencia. En las arteriolas aisladas se estudió la respuesta funcional al flujo y para medir la producción de NO se implementó una técnica usando el indicador fluorescente específico para NO, diacetato de 4, 5 diaminofluoresceína (DAF/DA). Los mesenterios se perfuridieron a 2 mL/min y se sometieron a un rápido cambio de flujo a 1, 5 ó 10 mL/min por 10 mm, retomando luego al flujo basal de 2 mL/mm. El aumento del flujo indujo un incremento bifásico en la producción de NO: una fase inicial transitoria que tuvo un pico a los 15 seg y decayó en 3-5 min a una fase sostenida que se mantuvo estable hasta el término de la estimulación. En las arteriolas aisladas el alza del flujo también produjo un aumento en la producción de NO en dos fases, lo que se asoció con una rápida y estable vasodilatación sensible a N°-nitro-L-arginina (L-NNA), un inhibidor de la NOS. En el mesenterio y en los vasos aislados la producción de NO fue proporcional al flujo y se redujo en un 50-70% con 30-100 iM L-NNA. En la microcirculación de la mejilla del hámster la liberación basa¡ de NO fue de 60 ± 5 pmol/min y la aplicación tópica de 30 ViM L-NNA la redujo en un --80 % después de 30-45 mm. La perfusión de los mesenterios con una solución sin calcio más lmM EGTA abolió la fase inicial transitoria de la producción de NO, sin afectar la fase sostenida, la que alcanzó el máximo dentro de los primeros 15 seg. El vaciamiento de los almacenes intracelulares de calcio con la aplicación de 10 mM cafeína por 30 mm (sin calcio extracelular) produjo un resultado similar. En los mesenterios peri undidos a 2mL/min y en la mejilla del hámster, la eNOS se encontró principalmente en la fracción microsomal (-66 %). La estimulación de los mesenterios por 1 min con 10 mL/min causó una reducción en el contenido de eNOS microsomal y un aumento del contenido de la enzima en el citosol y en la fracción subcelular precipitada a 10.000g (núcleo, citoesqueleto y mitocondrias). La producción de NO se correlacionó inversamente con el contenido de eNOS microsomal (r=0,83). Con el estímulo de 10 mL/min el contenido de eNOS microsomal se redujo en un 44 % en la fase transitoria (p<0,00I) y un 21 % en la fase sostenida (n.s.), retornando al nivel basal 2 mm después de la estimulación. Además, la eNOS co-inmunoprecipitada con caveolina-1 disminuyó en un 40-50 % durante la fase transitoria. En ausencia de calcio extracelular no se produjo la translocación transitoria de la eNOS y no hubo correlación significativa entre la producción de NO y el contenido de eNOS microsomal. En estas condiciones tampoco disminuyó la cantidad de eNOS inmunoprecipitada con caveolina-1. En la microcirculación de la mejilla del hámster estudiamos la translocación de la eNOS usando el activador de la eNOS dependiente de calcio ACh. La aplicación tópica de ACh (10-100tM, 10 mm) indujo un aumento neto en la producción de NO proporcional a la concentración (154±54 pmol de NO con 10 jM, n5 y 350±124 pino¡ de NO con 100 tM, n=6). Este aumento fue inhibido por 30 piM L-NNA. La ACh indujo, en paralelo a la producción de NO, una reducción en el contenido de eNOS microsomal, mientras el contenido de caveolina-1 no cambió. Respectivamente, después de 1,5, 3 y 6 min de aplicación de ACh, la eNOS unida a membrana se redujo en 13±4 O,/, 60±4 % y 19±17 % con 10 1.tM y en 38±9 %, 61±16 % y 40±18 % con 100 tM. En el mesenterio, la inhibición de la fosfatidilinositol 3-OH quinasa (PI3K) con 1 p.M wortmanriina abolió la fase sostenida de la producción de NO inducida por flujo y redujo la fase transitoria. La eliminación del calcio extracelular en los mesenterios tratados con wortmannina produjo una reducción adicional en la fase transitoria. Usando anticuerpos específicos contra la eNOS y la Akt fosforiladas, se detectó la presencia de la eNOS fosforilada en la seria 1177 y de la Akt fosforilada en la seria 473 en condiciones basales (2 mL/mm). La seria 1177 de la eNOS es un posible sitio para la fosforilación por Akt, la cual es un efector de la PI3K. La estimulación con 10 mL/min por 1 min produjo un aumento en la fosforilación de la Akt y la eNOS asociado a un incremento en la producción de NO. En la microcirculación del hámster, la wortmannina redujo la producción de NO (-30 %, a los 45 mm) y consecuentemente, los diámetros de las arteriolas y el flujo sanguíneo microvascular (la conductancia vascular relativa, cayó --40-50 % a los 45 mm). En el mesenterio, el bloqueo de las uniones comunicantes con 75 tM de ácido 18a glicirretínico inhibió específicamente las dos fases de la producción de NO inducida por flujo, mientras no afectó la respuesta vasoconstrictora a noradrenalina, relajadora a ACh, ni la producción de NO inducida por ACh o clonidina. En la mejilla del hámster, el bloqueo de las uniones comunicantes con 75 j.tM de ácido 1 8a glicirretínico redujo la liberación basal de NO, pero, no afectó la respuesta a 100 .tM ACh. Estos resultados indican que el estímulo del flujo induce una producción de NO en dos fases, que se sobreponen en el tiempo y dependen de distintos mecanismos de activación de la eNOS. Una fase inicial transitoria dependiente de calcio y una fase sostenida independiente de calcio, dependiente de la fosforilación de la eNOS en la seria 1177 por la vía de transduccióri PI3K-Akt. La activación transitoria de la eNOS se asocia con la transiocación de enzima desde la membrana hacia compartimentos intracelulares. Además, las uniones comunicantes facilitan la producción de NO en respuesta al flujo, posiblemente porque las células endoteliales son activadas por el flujo en forma desigual y la comunicación intercelular permiten una respuesta coordinada por todo el endotelio.PFCHA-BecasDoctor en Ciencias Fisiológicas162 p.PFCHA-BecasTERMINADA