ABSTRACT The molecular-endocrine mechanisms involved in the differentiation of sex in bivalve molluscs are almost completely unknown. However, agents of sex differentiation of vertebrates known as “sex steroids” have been established also in invertebrates. In our country, highlights the mussel Choromytilus chorus by their ecological and economic importance, and for presenting a particular condition in the coloring of the gonad; being female dark brown and the male yellowish cream, a condition which would separate populations of male and females in the bivalve aquaculture to obtain populations “all male”, since in the plants of processes reject females by its coloring. In consequence, the objectives of this study were to evaluate the effect of sex steroids on the early sexual differentiation of juveniles of the mussel C. chorus, and due to the re-establishment of this resource in the north of Chile was made a standardization of biological-reproductive parameters. Also, was made a selection and validation of reference genes as an internal control to study the expression of genes in tissue of C. chorus, as a first step for studies on the expression of genes related to the sexual differentiation. For this, individuals of C. chorus were collected in the coast of Antofagasta (24°S) from December 2014 until June 2015. A total of 1,620 individuals, with sizes between 5 mm to 100 mm, classified in 17 ranges of size, they were examined using histological techniques, and frotis. Subsequently, in September 2015 juveniles were selected with length of 15-22 mm, to be subjected to the exposure in the form of water bath during 60 days, four treatments plus one control: 1) 17β-estradiol, 2) Dihydrotestosterone, 3) Fadrozol and 4) Dihydrotestosterone plus Fadrozol and 5) control without the application of chemicals. Also, determined the levels of expression relative and the stability of twelve candidate genes in C. chorus, in different stages of the ontogeny, tissue and sex. The results indicated that of the total number of individuals sampled, 49% were males and 51% were females, mussels with sizes between the 22-24 mm began to differentiate sexually in the range of 38-40 recorded the size of first sexual maturity. It was noted that the mussels subjected to treatment with 17β-estradiol had a sex ratio (male: female) changed to 0.47, compared to 1:1 in the control group. In contrast, in the groups treated with DHT, F and DF was observed an increase in this reason of 2.0, 1.60 and 1.70, respectively. In the trials of fertilization it was observed that all the mussels were functional gametes, since they were able to generate gametes that were developed to morula, and larva velígera. The analysis indicated that the genes 28S (100% efficiency) and 18S (100% efficiency) were the most stable HKG genes in all tissues, sexes and size ranges tested. Analyzes with BestKeeper showed that 18S and 28S were the most stable genes. These results could help future researches on reproduction, sexual differentiation, thermoregulation and endocrinology in C. chorus. Thus, this research allows us to understand some key aspects of sexual differentiation in bivalve molluscs.RESUMEN Los mecanismos moleculares- endocrinos involucrados en la diferenciación sexual en los moluscos bivalvos se desconocen casi por completo; no obstante, los agentes de diferenciación de esteroides sexuales en vertebrados esteroides sexuales han sido establecidos también en invertebrados. En nuestro país, se destaca el mejillón Choromytilus chorus por su importancia ecológica y económica, y por presentar una condición particular en la coloración de la gónada; siendo la gónada femenina de color café oscuro y la masculina crema-amarillenta, condición que permitiría distinguir machos y hembras en los cultivos para la obtención de “poblaciones todo macho", ya que en las plantas de procesos rechazan las hembras por su coloración. En consecuencia, los objetivos de este estudio fueron evaluar el efecto de los esteroides sexuales en la diferenciación gonadal temprana de juveniles del mejillón C. chorus. Además, y debido al restablecimiento de este recurso en el norte de Chile se realizó una estandarización de parámetros biológicos-reproductivos. También, se realizó una selección y validación de genes de referencia como control interno para estudiar la expresión de genes en tejido de C. chorus, como un primer paso para estudios de expresión de genes relacionados a la diferenciación sexual. Para esto, individuos de C. chorus fueron recolectados en la costa de Antofagasta (24°S) desde diciembre 2014 hasta junio 2015. Un total de 1.620 individuos, con tallas entre 5 mm hasta los 100 mm, clasificados en 17 rangos de tallas, fueron examinados mediante histología. Posteriormente, en septiembre de 2015 se seleccionaron juveniles con talla de 15-22 mm, para ser sometidos a la exposición agua en forma de baño durante 60 días a cuatro tratamientos más un control: 1) 17β-estradiol (E2), 2) Dihidrotestosterona (DHT), 3) Fadrozol (F) y 4) Dihidrotestosterona más fadrozol (DF) y 5) control sin aplicación de químicos. También, se determinaron las eficiencias y estabilidad de 12 genes candidatos en C. chorus, en diferentes estadíos del desarrollo ontogenético, tejido y sexo. Los resultados mostraron que del total de los individuos muestreados, 49% fueron machos y 51% fueron hembras. Los mejillones con tallas entre los 22-24 mm empezaron a diferenciarse sexualmente y en el rango 38-40 se registró la talla de primera madurez sexual (50% de los individuos maduros). Se observó que los mejillones sometidos al tratamiento con 17β presentaron una proporción sexual (macho: hembra) de 0.47, comparada a 1:1 en el grupo control. En cambio, en los grupos tratados con DHT, F y DF se observó un incremento en esta razón de 2.0, 1.60 y 1.70, respectivamente. En los ensayos de fecundación se observó que todos los mejillones produjeron gónadas con gametos funcionales, ya que fueron capaces de generar gametos que se desarrollaron a mórula, y larva velígera. Los análisis indicaron que los genes 28S (100% de eficiencia) y 18S (100% de eficiencia) fueron los genes de referencia más estables en todos los tejidos, sexo y rangos de tallas ensayados. Los análisis con el algortismo estadístico Bestkeeper señalaron que los genes 18S y 28S fueron los genes más estables. De este modo, la presente investigación permitió demostrar el efecto de diversos esteroides sobre la diferenciación sexual de C. chorus y comprender aspectos claves referentes a las bases moleculares y fenotípicas involucradas en la diferenciación sexual en los moluscos bivalvos.PFCHA-BecasPFCHA-Becas