La tubulogénesis es la organización de células epiteliales para formar estructuras tubulares, proceso común en la formación de numerosos órganos. Puede involucrar varios procesos celulares, dentro de los que se incluye la diferenciación y desdiferenciación celular, polarización, cambios de forma, proteólisis, crecimiento, mitosis, adhesión, reorganización del citoesqueleto y del tráfico de membrana. En los últimos años, el principal modelo in vitro para el estudio de tubulogénesis se ha basado en el cultivo de células epiteliales en geles tridimensionales conformados por elementos de matriz extracelular (ECM), las cuales forman estructuras esféricas, y en presencia de factores de crecimiento, desarrollan un amplio proceso de tubulogénesis. Gracias a dicho modelo, se han caracterizado algunas señales y eventos involucrados en la generación de estructuras tubulares, como es la transición epiteliomesénquima (TEM), proceso en el cual algunas células pierden sus propiedades epiteliales, ganando características de células mesenquimáticas en morfología, motilidad, adhesión y expresión génica. Sin embargo, a pesar de los adelantos proporcionados por este modelo in vitro, sus características hacen dificil estudios cuantitativos del proceso de tubulogénesis. En nuestro laboratorio hemos obtenido a partir de mucosa gástrica de rata la línea celular de características epiteliales ERG-2. Tras llegar a la confluencia, en los cultivos de células ERG-2 se pueden observar algunas subpoblaciones celulares que cambian su morfología poligonal por otra de tipo alargado. A partir de estas subpoblaciones, cuando los cultivos son mantenidos en bajas concentraciones de suero fetal bovino (0,25%) se desarrollan estructuras tubulares ramificadas, que se caracterizan por poseer lumen y estar conformadas por células polarizadas. Dado lo anterior, planteamos a las células ERG-2 como un buen modelo de estudio de la tubulogénesis in vitro. En el presente trabajo de tesis se pretendió iniciar la caracterización de la tubulogénesis en las células ERG-2, abarcando tópicos de interés en dicho proceso, como son la plasticidad celular, influencia de factores de crecimiento y elementos de matriz extracelular. Basándonos en los antecedentes de literatura y observaciones de nuestro modelo, planteamos la hipótesis de que las células ERG-2 sufren un proceso de TEM, el cual antecede a la tubulogénesis. Así mismo planteamos una segunda hipótesis que consiste en que la fibronectina, y los factores de crecimiento HGF, EGF y TGF-0 1 podrían modular el proceso de tubulogénesis en las células ERG-2. Para estudiar cuantitativamente el proceso de tubulogénesis en las células ERG-2, se desarrolló un método de contabilización de estructuras tubulares por un área determinada, lo que arrojó diferencias significativas en la magnitud de la tubulogénesis de células tratadas con 10% SFB, 0,25% SFB y HGF. Para demostrar que las subpoblaciones de células ERG-2 que pierden su morfología poligonal sufren un proceso de transición epitelio-mesénquima se utilizó tres estrategias. En primer lugar, se estudió la expresión de vimentina, un marcador mesenquimático. Además, se estudió la pérdida de la polaridad apical-basolateral de las células. Para ello se detectó marcadores típicamente basolaterales, como los elementos de matriz extracelular fíbronectina, laminina, en las regiones correspondientes a la cara apical de las células que expresaban vimentina. Esta deslocalización basolateral también fue observada para otros marcadores como E-cadherina, N-CAM y el Tf-R. Finalmente, se estudió una posible desregulación negativa de la proteína de adhesión intercelular E-cadherina. A pesar de que la expresión de dicha proteína no parecía disminuir en los cultivos de células ERG-2, su localización celular era preponderantemente citoplasmática, y no formando parte de complejos de unión. Estudios de localización de E-cadhenna tras tratamientos de inhibición de la endocitosis mediada por clatrina y de endocitosis de la proteína marcada con anticuerpos, sugieren fuertemente que esta proteína de adhesión está siendo endocitada constitutivamente por las células ERG-2. Todos los antecedentes obtenidos apoyan la hipótesis de que ciertas subpoblaciones de células ERG- 2 sufren un proceso de transición epitelio-mesénquima en estadios tempranos de cultivo, previo a la formación de estructuras tubulares. Además, se estudió la proliferación en estas células, determinándose que una vez llegados los cultivos a la confluencia, la baja concentración de SFB estimula la proliferación de algunas subpoblaciones de la monocapa, que darían origen a los túbulos, así como la inhibición de la proliferación inhibe la formación de dichas estructuras. Se ha observado en otros sistemas in vitro, que la matriz extracelular resulta de gran importancia en la modulación del proceso de tubulogénesis. Además, nosotros determinamos que la fibronectina se puede asociar a células ERG-2 en transición epitelio-mesénquima, por lo que se propuso que este elemento de matriz extracelular podría modular la tubulogénesis en éstas células. Para determinar la validez de esta hipótesis, se estudiaron los niveles de fibronectina asociada a extractos celulares, determinándose una correlación directa entre la cantidad de proteína y las condiciones que inducen la tubulogénesis. Además, se colocalizó la fibronectina ensamblada en la superficie correspondiente al lado apical del cultivo con su receptor, la integrina a513 1. Tratamientos con el péptido RGD afectaron dichos depósitos de fibronectina, además de inhibir el número de células en proliferación en estadios tempranos del cultivo, así como también inhibieron fuertemente la tubulogénesis. Finalmente, se estudió el efecto de tres factores de crecimiento sobre el proceso de tubulogénesis de las células ERG-2: HGF, EGF y TGF-31. Determinamos que tanto el HGF como el EGF son fuertes inductores del proceso tubulogénico en nuestro sistema, mientras que el TGF- 1, inhibe tanto la tubulogénesis inducida por la baja concentración de suero, así como el efecto inductor de EGF y HGF. Además pudimos determinar mediante el uso de inhibidores, que la actividad de las enzimas PI3K y PKA eran necesarias para la tubulogénesis estimulada por bajas concentraciones de suero como por HGF y EGF, mientras que la inhibición de las qui nasas MEK- 1/2 estimulan la tubulogénesis en las condiciones ensayadas. De nuestros resultados se desprende que tanto fibronectina como los factores HGF, EGF y TGF-31, pueden modular el proceso de tubulogénesis en células ERG-2. Con este trabajo de tesis, se ha iniciado la caracterización del modelo in vitro de tubulogénesis de células ERG-2, mostrando que este sistema puede ser una importante herramienta tanto para el estudio de procesos celulares involucrados en la tubulogénesis, como la transición epitelio-mesénquima, así como para caracterizar el efecto de elementos de matriz extracelular o factores de crecimiento sobre la modulación del proceso.PFCHA-BecasDoctor en Ciencias Biológicas Mención Biología Celular y Molecular200p.PFCHA-BecasTERMINADA