Tesis Doctorado
cambios celulares y moleculares durante el desarrollo in vitro de mesocestoides corti
Autor
Espinoza-Grandón, Ingrid
Institución
Resumen
Los Eucestodos, subclase principal de los Cestodos, Phyla Platelmintos, son
endoparásitos obligados patógenos comunes de humanos y otros vertebrados. Usualmente
presentan un ciclo de vida indirecto, con una forma larval con reproducción asexual en un
hospedero intermediario y una forma adulta (gusano) con reproducción sexual en un hospedero
definitivo. Un representante de este grupo es Mesocestoides corti, el cual tiene como hospedero
intermediario a reptiles y mamíferos, albergando la forma larval o tetratiridio, y como hospedero
definitivo, a mamíferos carnívoros, incluido el hombre, en los que se encuentra la forma adulta
del parásito. La adquisición de formas diferentes en función de los hospederos que parasitan es
uno de los problemas no resueltos de la biología parasitaria de Cestodos. Es por esta razón, que
la presente tesis pretende establecer algunas bases celulares y moleculares de la morfogénesis en
Eucestodos parásitos.
M. corti constituye un modelo de estudio muy interesante para la biología del desarrollo,
debido a que posee una serie de características novedosas, como son la gran plasticidad de
desarrollo y un potencial de morfogénesis heterogéneo, poco frecuente en metazoos. Además, su
forma larval es fácilmente cultivable in vivo (ratones), y existen evidencias sobre la posibilidad
de obtener en cultivos in vitro su forma adulta. Este es un problema muy limitante para el estudio
de Cestodos.
La hipótesis afirma que en el proceso de morfogénesis de M. corti, desde el estado larval
a adulto, participan territorios celulares particulares y un conjunto de genes que son expresados
diferencialmente.
Se propone abordar la hipótesis desde dos aspectos, uno celular y otro molecular. Para
ésto, en primer lugar se establecieron las condiciones adecuadas para obtener un sistema de
cultivo in vitro que permitiera obtener en forma reproducible, sencilla y en cantidades suficientes
para realizar los diferentes estudios, las formas larval y adulta de M. cori!, además de sus
distintas formas intermedias (tetratiridios elongados y gusanos segmentados). Es así corno
encontramos que al incubar los tetratiridios en medio RPMI 1640 más tripsina (1 x 10
BAEEIm1) más 20% de suero, durante 24 horas a 37°C, indujimos el desarrollo post-larval del
parásito. En este sistema de cultivo in vitro, demostramos que tripsina produce graves daños a la
estructura externa del tetratiridio, las cuales se mantienen hasta aproximadamente el 4° día posttratamiento
con la proteasa, donde el tegumento que rodea el parásito y las microtrichas que
nacen de éste, comienzan a regenerarse, para posteriormente diferenciar y desarrollarse hacia el
estado de gusano adulto. Estos resultados nos llevaron a proponer un modelo para el posible
mecanismo de inducción del desarrollo de M. corti por tripsina.
Con este sistema establecido, posteriormente realizamos un análisis morfológico de las
distintas formas del parásito obtenidas in vitro, a través de técnicas microscópicas, identificando
tres regiones morfológicamente distinguibles: región anterior, media y posterior, con
características particulares cada una de ellas. Durante el desarrollo hacia gusano adulto, M. corti
experimenta un crecimiento en longitud, alcanzando un tamaño definitivo que corresponde
varias veces al tamaño del tetratiridio, este proceso necesariamente requiere de la existencia de
proliferación celular en el parásito, y nosotros logramos determinar que este proceso y el proceso
de diferenciación celular durante el desarrollo de M. corti, se encuentran temporalmente
desacoplados, ocurriendo primero la proliferación celular y luego la diferenciación. Además,
determinamos que los territorios celulares involucrados en el proceso de proliferación celular se ubican principalmente en las células asociadas a los cordones nerviosos del parásito que recorren
y unen las tres regiones identificadas anteriormente, y también en las células que forman la
masificación apical en la región anterior. Posteriormente, estas células migran hacia la zona
tegumental del parásito y el tetratiridio crece en longitud. De igual forma, encontramos que estas
regiones son las principales responsables de la síntesis de proteínas en M. corli. Sin embargo, la
mayor tasa de síntesis de proteínas tiene lugar en el tetratiridio, disminuyendo notoriamente
hacia el estado de gusano adulto, lo cual puede demostrar que la mayoría de las proteínas
estructurales y metabólicas del parásito se sintetizan en este estado y se acumulan en los estados
posteriores, permaneciendo una síntesis basa] de ellas, y apareciendo proteínas funcionales
propias de cada estado del desarrollo. Esto último se confirma, a través del análisis
electroforético de las proteínas totales de cada estado de desarrollo, donde encontramos la
existencia de un patrón de proteínas similar en los distintos estados larvales y la aparición de
proteínas diferentes en los estados de gusano segmentado y gusano adulto de M. corti, lo cual
demuestra la existencia de proteínas expresadas diferencialmente durante el desarrollo del
parásito. Entre las proteínas expresadas diferencialmente, encontramos actina, la cual presenta un
tamaño aproximado de 45kDa en el tetratiridio y tamaño aproximado de 50kDa en el gusano
adulto.
De esta forma, con el objetivo de identificar y analizar la expresión de algunos genes
marcadores de los procesos de proliferación o diferenciación celular, se clonó y secuenció el gen
de la histona H4 (posible gen marcador de proliferación celular) y el gen de -actina (posible gen
con expresión constitutiva). La expresión de estos genes y del gen de la enzima GAPDH (sonda
heteróloga) fue analizada mediante ensayos de Northem blots, encontrando que estos genes se expresan en forma diferencial en los distintos estados del desarrollo, lo cual tiene un determinado
significado biológico durante el desarrollo de M. corti.
De esta forma con esta tesis hemos logrado entender, en forma parcial, algunos de los
procesos que se llevan a cabo durante el desarrollo de M. corti, entregando algunas de las bases
celulares y moleculares que subyacen este proceso. PFCHA-Becas Doctor en Ciencias Biomédicas 186 p. PFCHA-Becas TERMINADA