Tesis Doctorado
Caracterización funciónal de la proteína rhogef3, un posible intercambiador de nucleótidos de rhogtpasas
Autor
Zuñiga-Prado, Alejandro Antonio
Institución
Resumen
La morfogénesis en el embrión de Orosophila requiere de la organizacióntridimensional de poblaciones de células con formas y comportamientos característicos de las cuales surgirán las estructuras del animal adulto. Los cambios de forma y movimiento coordinados de estos grupos de células tienen su origen en lareorganización del citoesqueleto de actina. Este proceso se encuentra dirigido por una compleja red de señalizaciones y bajo el control de las Rho GTPasas, encargadas de organizar los filamentos de actina en estructuras especializadas de la célu la. La actividad de las Rho GTPasas se encuentra, a su vez, finamente regulada a través de proteínas GAP (GTPase Activating Protein) y proteínas GEF (Guanine Exchange Factor), que modifican el estado de activación de las Rho GTPasas y permiten su articulación con diversas vías de señalización, siendo las responsables de dirigir temporal y espacialmente la acción de las GTPasas.En Drosophi!a existen 22 genes que codificarían para proteínas GEFs, de loscuales un numero reducido ha sido funcionalmente caracterizado durante el desarrollo, por lo que el estudio de estos genes y la caracterización de la función de sus productos proteicos parece fundamental para lograr una mayor comprensión de los mecanismosque regulan los cambios en la conducta celular durante la morfogénesis del epitelio embrionario. En este trabajo de tesis se propuso caracterizar molecular yfuncionalmente un nuevo GEF de Drosophila, denominado RhoGEF3. Para ello se formuló la siguiente hipótesis: La función de la proteína RhoGEF3 otorga especificidadespacial y temporal a la respuesta mediada por GTPasas, lo que se traduce en unareorganización del citoesqueleto de actina durante las etapas tempranas del desarrollo embrionario de Drosophila. Para abordar esta hipótesis se plantearon tres objetivos específicos: (1) Determinar la secuencia completa del cONA de rhogef3 y la expresión espacio-temporal de su transcrito y de su proteína; (2) Determinar in vitro la capacidadde la proteína RhoGEF3 de funcionar como intercambiador de nucleótidos de RhoGTPasas y de reorganizar el citoesqueleto de actina, y (3) Analizar el papel quecumple RhoGEF3 en estados tempranos del desarrollo, a través de la generación demutantes de pérdida y ganancia de función.Nuestros resultados indican que el gen rhogef3 es diferencialmente expresadodurante el desarrollo embrionario y su expresión se encuentra restringida en grupos particulares de células epitel iales. La generación de un anticuerpo anti-RhoGEF3 permitió detectar esta proteína en glándulas salivales, tráqueas y en el primordio del proctodeo. Esta proteína se localiza en la región apical de las células que componen la porción secretora de la glándula salival.Experimentos in vitro sugieren que la proteína RhoGEF3 promueve la disociación de GDP desde la GTPasa Rac1. Consistentemente, la expresión deRhoGEF3 es capaz de inducir el ensamblaje de estructuras similares a lamelas encultivos de célu las S2 y S2R+ de Drosophila. La pérdida de función de esta proteína afecta la morfología de las células S2R+, de manera similar a la pérdida de función de la GTPasa Rac1, no así de las GTPasas Rho1 y Cdc42. Los resu ltados obtenidos siguieren que in vivo la proteína RhoGEF3 participa en la regula ción espacial y temporal de la señalización mediada por GTPasas, particularmente en procesos dereorganización del citoesqueleto de actina, mediante la activación específica de la GTPasa Rac1. En experimentos en curso, estamos evaluando esta hipótesis en el contexto del desarrollo del embrión de Drosophila. PFCHA-Becas Doctor en Bioquímica 197p. PFCHA-Becas TERMINADA