Tesis Doctorado
In vitro anticancer and antioxidant activity of acid polysaccharides obtained from fungi belonging to the Hymenochaetaceae family associated with native forests in Chile.
Actividad anticancerígena y antioxidante in vitro de polisacáridos ácidos obtenidos desde hongos pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae asociados a bosque nativo de Chile.
Autor
Albornoz Muñoz, Verónica Agustina
Institución
Resumen
Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Cancer may be linked to hereditary factors or be favoured by bad habits such as excessive alcohol consumption, tobacco, or prolonged exposure to chemical components, among other factors. These conditions increase the production of reactive oxygen species (ROS), inducing oxidative stress, which produces damage to the genetic material that can induce the development of cancer. Conventional treatments applied for this disease, such as chemotherapy, have a high monetary cost and a great deterioration in the lifestyle of patients. Therefore, the search for new treatments or compounds, natural or synthetic, that can be successfully used in cancer control have generate great interest among scientists. Fungal polysaccharides have been shown to present a wide range of biological activities, such as antibacterial, hypoglycaemic, immunomodulatory, antioxidant and anticancer activity. The level of anticancer activity exhibited by fungal polysaccharides is related to their physicochemical characteristics, including their monomeric composition and the functional groups associated with the main chain of glucans. In this work, antioxidant, and cytotoxic capacity against tumour cell lines, of acid polysaccharides from four fungal strains belonging to the Hymenochaetaceae family present in the native forests of southern Chile, will be evaluated. Acid polysaccharides will be obtained from strains FQ1645 (Nothophellinus andinopatagonicus), FQ1626 and FQ1640 (Phylloporia boldo), and FQ1648 (possible Fomitiporia sp.), by selective precipitation with Cetavlon. The polysaccharides obtained (NAAPs, PBAP26, PBAP40, and APFQ48, respectively) were characterized by Fourier transform infrared analysis (FT-IR). In vitro anticancer activity was determined by MTT cytotoxicity assays and flow cytometry. Furthermore, the antioxidant capacity of polysaccharides was evaluated using the synthetic free radicals DPPH and ABTS. FT-IR analysis identified the presence of α and β-glycosidic linkages in both PBAP40 and APFQ48; while peaks corresponding to sulphate groups were evidenced in NAAPs and APFQ48. Cytotoxicity assays against tumour cell lines showed that three of the polysaccharides studied (NAAPs, PBAP40 and APFQ48) have a greater effect against the HL-60 cell line, with IC50 values of 767.16 μg mL-1, 127.85 μg mL-1 and 800 μg mL-1, respectively. On the other hand, the PBAP26 polysaccharide has a greater cytotoxic activity against the tumour cell line HCT-116, with an IC50 value of 535.83 μg mL-1. The evaluation of the cytotoxic effect of polysaccharides against a non-tumour cell line showed that all acid polysaccharides analysed have a proliferative effect on the HGF-1 cell line, obtaining survival values greater than 100% with the highest concentrations of polysaccharides used. Regarding the effect of polysaccharides on the cell cycle of the HL-60 cell line, it was observed that all polysaccharides produce an increase in events in the Sub G1 phase, assuming a cell arrest effect in this phase of the cell cycle. The antioxidant activity assays showed that the acid polysaccharides of the four strains under study have a greater reducing capacity of the DPPH radical compared to the ABTS radical; and that the polysaccharides PBAP40 and APFQ48 present the highest antioxidant activity with values of 24.53% and 27.31% of antioxidant activity, respectively. The polysaccharides analysed show significant in vitro anticancer activity against the cell lines used, HCT-116, MCF-7 and HL-60, especially against the latter. The bioactivity presented by NAAPs, PBAP26, PBAP40 and APFQ48 could be due to the presence of functional groups such as sulphate groups, as well as the existence of β-glucans. El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial. Su padecimiento puede estar vinculado con factores hereditarios, o verse favorecido por malos hábitos como el consumo excesivo de alcohol, de tabaco, o la exposición prolongada a componentes químicos, entre otros factores. Estas condiciones aumentan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), desencadenando stress oxidativo, el cual produce daños en el material genético que pueden inducir el desarrollo de cáncer. Los tratamientos convencionales aplicados para esta enfermedad, como la quimioterapia, presentan un alto costo monetario y un gran deterioro al estilo de vida de los pacientes; por lo que la búsqueda de nuevos tratamientos o compuestos, naturales o sintéticos, que puedan emplearse satisfactoriamente en el control del cáncer han despertado un gran interés en los científicos. Los polisacáridos de origen fúngico han demostrado presentar una amplia gama de actividades biológicas, tales como actividad antibacteriana, hipoglucémica, inmunomoduladora, antioxidante y anticancerígena. El nivel de actividad anticancerígena que presentan los polisacáridos fúngicos está relacionado con sus características físicoquímicas, incluyendo su composición monomérica y los grupos funcionales asociados a la cadena principal de glucanos. En este trabajo se evaluará la capacidad antioxidante y citotóxica contra líneas celulares tumorales, de los polisacáridos ácidos de cuatro cepas fúngicas, pertenecientes a la familia Hymenochaetaceae presente en bosques nativos del sur de Chile. Los polisacáridos ácidos serán obtenidos desde las cepas FQ1645 (Nothophellinus andinopatagonicus), FQ1626 y FQ1640 (Phylloporia boldo), y FQ1648 (posible Fomitiporia sp.), por medio de una precipitación selectiva con Cetavlon. Los polisacáridos obtenidos (NAAPs, PBAP26 y PBAP40, y APFQ48, respectivamente) fueron caracterizados por análisis infrarrojo con transformada de Fourier (FT-IR). La actividad anticancerígena in vitro fue determinada por análisis de citotoxicidad con MTT y citometría de flujo. Además, la capacidad antioxidante de los polisacáridos fue evaluada usando los radicales libres sintéticos DPPH y ABTS. El análisis de FT-IR permitió identificar la presencia de enlaces α y β-glicosídicos tanto en PBAP40 como en APFQ48; mientras que los picos correspondientes a grupos sulfatos fueron evidenciados en NAAPs y APFQ48. Los ensayos de citotoxicidad contra líneas celulares tumorales mostraron que tres de los polisacáridos estudiados (NAAPs, PBAP40 y APFQ48) presentan un mayor efecto contra la línea celular HL-60, con valores de IC50 de 767.16 μg mL-1, 127.85 μg mL-1 y 800 μg mL-1, respectivamente. Por su parte, el polisacárido PBAP26 presenta una mayor actividad citotóxica contra la línea celular tumoral HCT-116, con un valor de IC50 de 535.83 μg mL-1. La evaluación del efecto citotóxico de los polisacáridos contra una línea celular no tumoral permitió evidenciar que todos los polisacáridos ácidos analizados presentan un efecto proliferante en la línea celular HGF-1, obteniéndose valores de supervivencia mayores al 100% con las mayores concentraciones de polisacáridos usadas. En cuanto al efecto de los polisacáridos sobre el ciclo celular de la línea celular HL-60, se pudo observar que todos los polisacáridos producen un aumento de eventos en la fase Sub G1, suponiendo un efecto de arresto de células en esta fase del ciclo celular. Los ensayos de actividad antioxidante evidenciaron que los polisacáridos ácidos de las cuatro cepas en estudio presentan una mayor capacidad reductora del radical DPPH en comparación con el radical ABTS; y que los polisacáridos PBAP40 y APFQ48 presentan la mayor actividad antioxidante con valores de 24.53% y 27.31% de actividad antioxidante, respectivamente. Los polisacáridos analizados presentan una significativa actividad anticancerígena in vitro contra las líneas celulares empleadas, HCT-116, MCF-7 y HL-60, especialmente contra esta última. La bioactividad presentada por NAAPs, PBAP26, PBAP40 y APFQ48 podría estar dada por la presencia de grupos funcionales como grupos sulfatos, así como la existencia de β-glucanos. En primer lugar, agradecer a ANID-Chile (ex CONICYT) por otorgarme su Beca de Doctorado Nacional folio N° 21160525, la cual me permitió realizar el programa de doctorado y dedicarme a tiempo completo al desarrollo de mi investigación, al igual que ampliar mis conocimientos por medio de una pasantía internacional. Agradecer además, al programa de Doctorado en Ciencias mención Microbiología de la Universidad de Concepción, por darme la oportunidad de continuar mi formación profesión y complementar mis conocimientos en el área de la microbiología. De igual forma, a todos los funcionarios y docentes que forman parte del Departamento de Microbiología y al laboratorio de Química de Productos Naturales, por ser parte fundamental de mi formación y aprendizaje como doctorando en ciencias; en especial a mi director de tesis, Dr. Víctor Campos, y a mi co-director, Dr. José Becerra. Al Dr. Roberto Abdala Díaz y al Laboratorio del Departamento de Ecología, de la Universidad de Málaga (España); por aceptarme como alumna pasante y guiarme en el desarrollo de las etapas finales de mi investigación de tesis. Finalmente, agradecer a mi familia y a mis amigos por ser el soporte fundamental desde el primer momento en que decidí emprender este desafío. La tesis presenta datos que aún no han sido publicados, y con los cuales se está trabajando para generar un artículo en el corto plazo.