The objective of this study was to evaluate the in vitro antimicrobial effect of eucalyptus essential oil (Eucaliptus spp) on Escherichia coli ATCC® 11229 and Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 25904. Concentrations of 30, 60 and 90% were evaluated in dilution in 96.8% ethanol. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was determined by the broth microdilution method. The bacterial inoculum was standardized to 0.5 of the MacFarland scale in spectrophotometer, obtaining as a result that the concentrations of 60 and 90% did not present turbidity. The Minimum Bactericidal Concentration (MBC) determined in Mueller-Hinton agar was present from the 60% concentration for the two strains under study. The antimicrobial susceptibility test indicated that all concentrations showed antimicrobial sensitivity and that the concentrations at 30 and 60% were not significantly different, presenting halos of inhibition of 10.25 mm and 10.65 mm in the concentration of 30% for the strains of Escherichia coli and Staphylococcus. aureus subsp. aureus, respectively. On the other hand, the results for the strain S. aureus subsp. aureus showed that concentrations at 60% and 90% formed larger diameter halos than the E. coli strain.El objetivo del estudio fue evaluar el efecto antimicrobiano in vitro del aceite esencial de eucalipto (Eucaliptus spp) sobre Escherichia coli ATCC® 11229 y Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC® 25904. Se evaluaron concentraciones al 30, 60 y 90% en dilución en etanol al 96.8%. Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el método de microdilución en caldo. El inóculo bacteriano se estandarizó al 0.5 de la escala de MacFarland en espectofotómetro, obteniendo como resultado que las concentraciones de 60 y 90% no presentaron turbidez. La Concentración Mínima Bactericida (CMB) determinada en agar Mueller-Hinton se presentó a partir de la concentración del 60% para las dos cepas en estudio. La prueba de sensibilidad antimicrobiana indicó que todas concentraciones presentaron sensibilidad antimicrobiana y que las concentraciones al 30 y 60% no fueron significativamente diferentes, presentando halos de inhibición de 10.25 mm y 10.65 mm para la concentración de 30% para las cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus subsp. aureus, respectivamente. Por otro lado, los resultados para la cepa S. aureus subsp. aureus muestran que las concentraciones al 60% y 90% formaron halos de mayor diámetro que la cepa de E. coli.