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EFFECT OF TIME OF INCUBATION ON NUCLEAR MATURATION AND CLEAVAGE POST IN VITRO FERTILIZATION OF ALPACA OOCYTES
Evaluación de Cuatro Tiempos de Cultivo sobre la Tasa de Maduración y División Post-Fecundación in vitro de Ovocitos de Alpaca
Registro en:
10.15381/rivep.v25i4.10782
Autor
Huanca L., Wilfredo
Condori P., Rosario
Chileno M., María
García H., Pedro
Cainzo C., Juan
Becerra G., Juan J.
Institución
Resumen
The study was carried out to evaluate the effect of incubation time on nuclear maturation and cleavage rate of alpaca oocytes after 72 hours post-fertilization. Cumulusoocyte complexes (CCOs) were collected from ovaries collected at slaughterhouse and transported in saline solution 0.9% with antibiotic antimycotic at 35 ºC. CCOs were aspirated from 2-6 mm follicles. Experiment 1: 502 oocytes were distributed in four maturation times (30, 34, 38, 42 hours), matured in TCM-199 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (v:v), 0.5 μg/mL FSH, 10 μg/mL hCG, 0.2 mM sodium pyruvate, 50 μg/mL gentamicine and 1 μg/mL oestradiol, and cultivated at 39 ºC in an atmosphere of 5% CO2 and high humidity. After maturation, CCOs were removed from maturation medium and washed with PBS supplemented with 10% FCS and 1 mg/ml of hyaluronidase, and fixed in ethanol and acetic acid (3:1). Oocytes were placed on a glass slide, stained with 1% orcein and examined under microscope at 400x to evaluate nuclear maturation status. Experiment 2: 533 CCOs were culture under similar maturation protocols than experiment 1 and fertilized with epididymal spermatozoa. These were obtained by centrifugation at 700 g on a Percoll discontinuous gradient (22.5:45%) for 25 min. The supernatant was removed by aspiration and the pellet (containing viable spermatozoa) was re-suspended in TL Stock. Gametes were co-incubated for 18 h at 39 °C with 5% CO2 and cultivated in KSOM supplemented with 10% FCS (v:v), 0.2 mM sodium pyruvate and 50 μg/ml gentamicine, and evaluated in 72 hours. In experiment 1, 26.3±5.4, 52.6±6.7, 68.5±10.6 and 75.3±11.9% of oocytes were in M-II stage for the 30, 34, 38, and 42 h of culture respectively, with significant difference between 30 and 34 with respect to 38 and 42 h (p<0.05). In experiment 2, the cleavage rate was 9.5±4.8, 8.1±5.8, 15.6±9.2 and 19.8±8.0% for 30, 34, 38, and 42 h after culture, and without statistical difference between groups. These results indicate that is required 38-42 h for the maturation of alpaca oocytes. Se evaluó el efecto del tiempo de cultivo sobre la tasa de maduración nuclear y tasa de división post-fecundación a 72 horas de ovocitos de alpacas. Complejos Cumulus-Ovocitos (CCOs) fueron obtenidos de ovarios procedentes de animales beneficiados en el camal y transportados a 35 °C en solución salina 0.9% suplementada con antibiótico antimicótico. Los CCOs fueron aspirados de folículos de 2 a 6 mm. Experimento 1: 502 ovocitos fueron distribuidos en cuatro tiempos de maduración (30, 34, 38 y 42 horas) y madurados en TCM-199 suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB), 0.5 µg/mL de FSH, 10 µg/mL de hCG, 0.2 mM de piruvato de sodio, 50 µg/mL de gentamicina y 1 µg/mL de E2, y cultivados a 39 ºC bajo una atmósfera de 5% de CO2 y alta humedad. Posteriormente, los ovocitos fueron removidos, lavados con PBS suplementado con 10% de SFB y 1 mg/ml de hialuronidasa y fijados en solución de etanol y ácido acético (3:1). Los ovocitos fueron colocados en portaobjetos, teñidos con 1% de orceína y examinados bajo un microscopio a 400x para determinar la maduración nuclear. Experimento 2: 533 ovocitos fueron cultivados bajo las mismas condiciones del experimento 1 y fecundados con espermatozoides obtenidos de epidídimos. Los espermatozoides fueron centrifugados a 700 g en una gradiente de Percoll discontinua (22.5:45%) por 25 minutos. El sobrenadante fue removido y el pellet (con espermatozoides viables) reconstituido con TL-Stock. Los gametos fueron co-cultivados por 18 horas a 39 ºC con 5% de CO2 en KSOM suplementado con 10% de SFB, 2 mM de piruvato de sodio y 50 µg/mL gentamicina, y evaluados a las 72 horas. En el Experimento 1 se obtuvo el 26.3±5.4, 52.6±6.7, 68.5±10.6 y 75.3±11.9% de ovocitos en Metafase-II para 30, 34, 38 y 42 h de cultivo, respectivamente, con diferencia estadística entre 30 y 34 h respecto a 38 y 42 h (p<0.05). En el Experimento 2, la tasa de división fue 9.5±4.8, 8.1±5.8, 15.6±9.2 y 19.8±8.0% para 30, 34, 38 y 42 h, sin diferencia estadística entre grupos. Los resultados sugieren que los ovocitos de alpacas requieren 38 a 42 h de maduración para obtener estadios de Metafase-II.