Preservation methods of spermatozoa using refrigeration have been developed for canine sperm; however, the rate of fertilization is still low, possibly due to cell damage for unknown reasons. The objective of this study was to evaluate the effect of refrigeration upon motility, mitochondrial activity, acrosomal membrane integrity, and acrosomal reaction in dog sperm incubated in three culture media (Ferp Talp, CCMm, Sp Talp) using new methodologies (Mito Tracker, Lyso Tracker, SBTI). The results indicated that exist a significant decrease (p<0.05) in motility, mitochondrial activity, and acrosomal membrane integrity in refrigerated sperm in comparison with fresh sperm. Also, the dynamic of acrosomal reaction was different in refrigerated sperm in comparison with fresh sperm. The Sp Talp and CCMm media showed the best results in holding the mitochondrial activity and acrosomal membrane integrity.Métodos de preservación de espermatozoides mediante la refrigeración o el congelamiento han sido desarrollados para espermatozoides caninos; sin embargo, la tasa de fecundación artificial es baja, posiblemente por daños celulares aún no determinados. El objetivo de este estudio fue evaluar el efecto de la refrigeración sobre la motilidad, actividad mitocondrial, integridad de membrana acrosomal y reacción acrosomal en espermatozoides caninos incubados en tres medios distintos (Ferp Talp, CCMm, Sp Talp), utilizando nuevas metodologías (Mito Tracker, Lyso Tracker, SBTI). Los resultados indicaron una disminución significativa (p<0.05) en la motilidad, viabilidad e integridad del acrosoma en espermatozoides refrigerados en comparación con los frescos; así como una dinámica de reacción diferente en espermatozoides refrigerados respecto a los frescos. Por otra parte, los medios Sp Talp y CCMm dieron mejores resultados en mantenimiento de la motilidad, actividad mitocondrial e integridad de membrana acrosomal.