Tesis
Diseño y construcción de vectores para la transformación del cloroplasto de frijol Phaseolus vulgaris
Fecha
2016-11-04Autor
Velázquez Sánchez, Margarita
Institución
Resumen
El frijol común (Phaseolusvulgaris) es un cultivo económicamente importante y una de las principales leguminosas para consumo humano en América Latina, África y Asia. A pesar de su importancia, el incremento en su producción es limitada debido a patógenos virales, hongos bacterias e insectos, falta de tolerancia a la sequía y las deficiencias nutricionales. Por tanto, existe un gran interés en el desarrollo de nuevos cultivares de frijol con características agronómicas útiles. La mayoría de plantas transformadas genéticamente obtenidas hasta el momento son el resultado de la transferencia de ADN al genoma nuclear. Las plantas además contienen un genoma en la mitocondria y en los plástidos o cloroplastos. Este último puede ser modificado con genes que confieren características a plantas que pudieran tener aplicaciones en la industria biotecnológica y muchas ventajas con respecto a la modificación del genoma nuclear. Entre otras ventajas, se encuentran una estabilidad mayor de los transgenes y una herencia materna de los cloroplastos, evitando así la presencia de transgenes en el polen.
En este trabajo se diseño y construyó de un vector específico para la modificación genética de frijol (Phaseolus vulgaris). Para la construcción del vector se utilizó la región atpB-rbcL de 3 kb que contiene un sitio único de restricción en la región intergénica en la cual se insertó un sitio múltiple de clonación. En este sito se insertó el gen aadA que confiere resistencia a espectinomicina a las especies sensibles a este antibiótico y el gen que codifica para la proteína verde fluorescente (gfp). El vector se caracterizó molecularmente y por secuenciación. La funcionalidad del vector se comprobó por la capacidad de conferir resistencia a la espectinomicina y por la capacidad de las células de emitir fluorescencia; así como introduciendo este vector en cloroplasto de hojas de P. vulgaris por biobalística, observándose fluorescencia en cloroplastos usando un microscopio confocal de barrido laser. También, se realizaron ensayos preliminares para establecer un protocolo de regeneración in vitro de P. vulgaris.
ABSTRACT
Common bean (Phaseolus vulgaris) is an economic important crop and one of the major grain legumes for human consumption in Latin America, Africa and Asia. Despite its importance, production growth rates are limited by viral, fungal and bacterial pathogens, insects, lack of drought tolerances and nutritional deficiencies of soil. Therefore, there is considerable interest in the development of new bean cultivars with useful agronomical traits. Most genetically transformed plants obtained so far are the result of transfer of DNA into the nuclear genome. Plants also contain a genome in the mitochondria and plastids or chloroplasts. The latter can be modified with genes that confer characteristics to plants that may have applications in the biotechnology industry and many advantages over the nuclear genome modification. Other advantages include greater stability of transgenes and uniformly transmitted maternal seed progeny, thus avoiding the presence of transgenes in pollen.
In this work, it was completed the design and construction of a specific vector for common bean (Phaseolus vulgaris) genetic modification. For the construction of the vector atpB-rbcL of 3 kb first was inserted a multiple cloning site (MCS) and in this site was inserted the aadA gene that confers resistance to spectinomycin to susceptible species. And then was inserted gene encoding the green fluorescent protein (gfp). The vector was molecularly characterized and by sequencing. The functionality of the vector was verified by the ability to confer resistance to spectinomycin and the ability of cells to emit fluorescence. This vector was introducing into the chloroplast leaf of P. vulgaris by biolistic. Chloroplast fluorescence was observed using a laser scanning confocal microscope. Also, a preliminary study was to establish a protocol for in vitro regeneration protocol of P. vulgaris.