Inmunoterapia con las vacunas de ADN en la infección experimental con Trypanosoma cruzi en Macacos rhesus

Abstract

ABSTRACT: Trypanosomiasis Americana represents a primary health issue in the Americas. The World Health Organization (WHO) estimates that around 9 million people are infected with Trypanosoma cruzi. For the control of the Chaga's disease, several cellular populations are needed to activate, in particular T CD4+ y CD8+ cellular response has been observed in murine models and human clinic cases. Although Chagas disease is still active in extensor zones of Central and South America, there is no effective treatment extent of undesired secondary effects. Dumonteil et al. (2004) did experiments, using pcDNA-3 TSA-1 ADN TSA-1) y pcDNA-3 Tc24 (ADN Tc24) vaccines as immunotherapy in the acute and chronic stage. The immunotherapy with ADN TSA achieves parasitemia reduction and obtains survivance of 70% in the acute stage presenting a high parasitemia and dying in the next 45 days. In the chronic stage it was presented a reduction in the hearth tissue as well as an increase in the CD8+ lymphocytes that produce IFN-y. Immunotherapy with ADN Tc24 in accute stage produces a survivance of 83% as well as a reduction in the number of parasites allocated in cardiac tissue. Recently the efficiency of the TSA-1 y ADN Tc24 ADN plasmids in mice and a reduction in the parasite load time detection was observed. It is necessary to evaluate an experimental model with analog characteristics to those present in humans. Nine 5 to 9 years old M. mulatta were infected with 3.5 x 105 Y strain trypomastigotes of T. cruzi After that they were divided into two groups of four M. mulatta (control) and five (immunotherapy with ADN TSA-1 + ADN Tc24) individuals respectibly. In the 11th week after the infection the first 1mg dose was administered via intramuscular injection. In the 15th week the second dose was administered. To the witness group only a void plasmid (pcDNA-3) was administered. The parasitemia count was performed with a Newbauer camera, taking a peripheral blood sample. Every week physical and clinical tests were performed. With a 100 ng DNA hearth tissue biopsy, presence of T.cruzi was analyzed via PCR technique. Populations of T CD4+ and T CD8+ lymphocytes were analyzed via flow citometry. Results. It was not possible to detect the presence of parasites in the peripheral blood. Although all experimental groups were positive for the parasite presence via PCR in blood and hearth biopsies. Although the monkeys were infected with T.cruzi electrolytes (Na, Cl and K) parameters were found in the normal range as well as BUN, creatinine, and the BUN/creatinine ratio in the experimental group. The globulin values and the A/G ratio were found below the normal levels as well as the values for AST and ALT for both groups. Because of the heterogeneity of the macaques in the number of lymphocytes T CD4+ and CD8+ at zero time, it was not possible to establish if the immunotherapy modified these parameters. The present work is a pilot study in M. mulatta to found the basis for further analyses in immunotherapy with ADN TSA-1+ ADN Tc24.

RESUMEN: La Tripanosomiasis americana, representa uno de los principales problemas de salud pública en América. La Organización Mundial de la salud (OMS) estima que cerca de 9 millones de personas se encuentran infectadas con Tripanosoma cruzi. Para el control de la enfermedad de Chagas es necesario la activación de diferentes poblaciones celulares particularmente se ha observado en modelos murinos y casos clínicos humanos una respuesta de células T CD4+ y CD8+. A pesar de que la enfermedad de Chagas, se mantiene activa en extensas zonas de centro y sur de América aún no existe un tratamiento eficaz y exento de efectos secundarios indeseables. Dumonteil et al. (2004) realizarón experimentos, empleando la vacuna de pcDNA-3 TSA-1 (ADN TSA-1) y pcDNA-3 Tc24 (ADN Tc24) como inmunoterapia en la fase aguda y crónica de la enfermedad de Chagas. La inmunoterapia con ADN TSA-1logró disminuir la parasitemia y obtener una sobrevivencia del 70% en la fase aguda en contraste con los ratones que no recibieron la inmunoterapia, los cuales presentarón una alta parasitemia, sucumbiendo a los 45 días posteriores a la infección. En la fase crónica se presentó una reducción en el daño en el tejido del corazón así como un incremento de los linfocitos CD8+ productores de IFN-y. La inmunoterapia con ADN Tc24 en la fase aguda presentó una sobrevivencia del 83%, así como la reducción en el número de parásito alojados en el tejido cardiaco en contraste con sus respectivos controles. Recientemente se evaluó la eficacia en ratones con la mezcla de los plásmidos ADN TSA-1 y ADN Tc24 observándose una reducción en el tiempo de detección de la carga parasitaria en los animales tratados con respecto a la administración individual de cada uno de los plásmidos. Por lo que es necesario evaluar un modelo experimental con características análogas a lo que se presentan humanos con la enfermedad de Chagas. Se infectaron nueve M. mulatta de 5 a 9 años de edad por vía subcutánea en el brazo con 3.5 x 105 tripomastigotes de T. cruzi de la de la cepa Y. Posteriormente se dividieron en dos grupos experimentales de cuatro (testigo) y cinco macacos (inmunoterapia con ADN TSA-1 + ADN Tc24) cada uno. A la 11ava semana posterior a la infección (s.p.i) fue administrada la primera dosis de 1mg de la inmunoterapia ADN TSA-1+ ADN Tc24 intramuscularmente. A las 15ava s.p.i se administró una segunda dosis. Al grupo testigo únicamente se le administró la construcción del plásmido vacio (pcDNA-3). El conteo de la parasitemia se realizó con cámara de Newbauer, tomando una muestra de sangre periférica; cada semana se realizarón exámenes rutinarios físicos y clínicos. A partir de 100 ng de ADN de una biopsia de cada corazón, se analizó la presencia de T.cruzi por la técnica de PCR. El análisis de las poblaciones de linfocitos T CD4+ y T CD8+ se realizarón por citometría de flujo. Resultados. No fue posible detectar la presencia de parásitos en sangre periférica, sin embargo todos los grupos experimentales fueron positivos para la presencia del parasito por medio de PCR en sangre y en biopsias de corazón. A pesar de que los macacos cursaban una infección con T.cruzi los parámetros de los electrolitos: Na, Cl y K se encontraron dentro de los intervalos normales, al igual que BUN, creatinina, y la relación BUN/ creatinina en los grupos experimentales. Los valores de globulina y la relación A/G se encontraron por debajo de los parámetros considerados como normales, así como los valores de AST y ALT para ambos grupos. Debido a la heterogenesidad de los macacos, en lo que respecta al número de linfocitos T CD4+ y CD8+ en el tiempo cero no fue posible establecer si la inmunoterapia modifica estos parámetros. El presente trabajo es un estudio piloto en M. mulatta que sentara bases para análisis posteriores para evaluar la inmunoterapia con ADN TSA-1+ ADN Tc24.