Detección de posibles factores de virulencia de Vibrio mimicus aislado de agua y alimentos

Abstract

ABSTRACT: Vibrio mimicus is a bacterium inhabiting aquatic environments; it has been isolated from fresh and salt water shores, estuaries, rivers, lakes, and lagoons in temperate and warm climates, It is found as part of the microbiota of zooplankton, in crustacea and molluscs that feed through filtration. Its transmission to humans occurs through food, like oyters, turttle eggs, shrimp, and fish that are consumed raw or barely cooked, causing gastroenteritis and severe cholera-type diarrhea. Among the Vibrio genus, V. mimicus and V. cholerae are the most phylogenetically related species, sharing multiple phenotypic and genotypic characteristics. The pathogenicity mechanism of V. mimicus is still unknown; however, some factors associated to virulence have been described, such as hemolysins, hemagglutinins, proteases, siderophores, enterotoxins, and the presence of VPI1 and of the CTX phage, which are necessary to cause similar symptoms to those of cholera. Based on this, the present work was aimed at studying the presence of some factors involved in the virulence of V. mimicus in environmental strains isolated from water, fish, and oysters in the coast line of the Gulf of Mexico. We worked with 20 V. mimicus strains isolated from the Pueblo Viejo lagoon in the state of Veracruz, Mexico; six isolates from water, five from fish, and nine from oysters. We used sheep and rabbit erythrocytes to determine hemolytic activity, CAS medium to detect siderophores, and Congo red staining to determine the presence of the capsule. In addition, we used polymerase chain reaction (PCR) to analyze the presence of genes encoding for hemolysin (vmhA), phage CTX (ctxA and zot), VPI1 (tcpA and tox), part of the aerobactin operon (iutA ,Inc. iucD), capsule (wza), and of a regulator gene (toxR). Likewise, we observed the cytotoxic capacity on the CHO cell line and the adherence on Hep-2 cells. Hundred percent of the studied strains were -hemolytic and possessed the hemolysin vmhA gene, confirming their identity as V. mimicus, neither phage CTX nor VPI-1 were found. All strains had the gene toxR. Forty percent of the strains produced hydroxamate-type siderophores in the CAS medium, and all amplified the aerobactin operon gene. The presence of a capsule in V. mimicus is described for the first time, and was confirmed by amplifying the homologous gene to wza. Seventy-five percent of the strains presented a cytopathic effect at 3 hours of exposition to the filtrate, observing destruction of the monolayer at 6 hours of exposure to the filtered supernatant. Filtrates showed titers from 1:3 to 1:81. All strains presented adherence to the HEP2 cell line, with an aggregating pattern. It was also demonstrated that the V. mimicus strains isolated from food possess the capacity to produce factors associated to virulence. In Mexico, there are no studies on V. mimicus isolates originating from fish products; therefore, these data are an important contribution to characterize the pathogenesis of this microorganism.

RESUMEN: Vibrio mimicus es una bacteria de hábitat acuático que se ha aislado de costas, estuarios, ríos, lagos y lagunas de agua dulce y salada de las zonas templadas o cálidas. Se encuentra formando parte de la microbiota del zooplancton, en crustáceos y moluscos que se alimentan por filtración. Los alimentos involucrados en su transmisión al humano son ostras, huevos de tortuga, camarón y pescado, que se consumen crudos o poco cocidos, causando casos de gastroenteritis y diarreas severas tipo cólera. Dentro del género Vibrio, V. mimicus y V. cholerae son las especies que están filogenéticamente más relacionadas, compartiendo múltiples características fenotípicas y genotípicas. En la actualidad se desconoce el mecanismo de patogenicidad de V. mimicus, sin embargo, se han descrito algunos factores asociados a la virulencia, como hemolisinas, hemaglutininas, proteasas, sideróforos, enterotoxinas y la presencia de la VPI1 y del fago CTX , necesarios para causar un cuadro similar al cólera. Por ello, en el presente trabajo se consideró de interés estudiar la presencia de algunos factores potencialmente involucrados en la virulencia de V. mimicus en cepas ambientales aisladas de agua, pescados y ostiones capturados en las costas del Golfo de México,. Se trabajó con 20 cepas de V. mimicus aisladas de la laguna de Pueblo Viejo Veracruz: 6 provenientes de agua, 5 de pescado y 9 de ostión. Se utilizaron eritrocitos de carnero y conejo para determinar la actividad hemolítica, el medio CAS para la detección de sideróforos y la tinción con rojo congo para la observación de la presencia de cápsula. Se hizo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se analizó la presencia de los genes para la hemolisina (vmhA), fago CTX (ctxA y zot), VPI1 (tcpA y tox), parte del operón de aerobactina (iutA ,Inc. iucD), cápsula (wza) y un gen regulador, (toxR). Se observó, asimismo, la capacidad citotóxica sobre la línea celular CHO y la adherencia sobre células HEp-2. El 100% de las cepas estudiadas resultaron ser -hemólíticas y poseen el gen de la hemolisina vmhA, confirmando su identidad como V. mimicus, no encontrándose en ellas el fago CTX ni la VPI-1.Todas las cepas tienen el gen toxR. El 40% de las cepas producen sideróforos de tipo hidroxamato en medio CAS y todas amplificaron los genes del operón de aerobactina. Por vez primera se describió en V. mimicus la presencia de cápsula en las cepas, corroborándose al amplificar el gen homólogo al wza. El 75% de las cepas presentaron efecto citopático a las 3 horas de exposición al filtrado, observándose destrucción de la monocapa a las 6 horas de exposición al sobrenadante filtrado. Los filtrados mostraron títulos desde 1:3 hasta 1:81. Se encontró que todas las cepas presentaron adherencia a la línea celular HEp-2, con un patrón de tipo agregativo. En el presente estudio se demostró que las cepas de V. mimicus aisladas de alimentos poseen la capacidad de producir factores asociados a la virulencia. En México no existen estudios sobre aislados de V. mimicus que provengan de productos de la pesca, por lo que nuestros datos son una contribución para describir el modelo de patogénesis de este microorganismo.