Tesis
Estandarización de un método no radiactivo para la medición de la actividad supresora de las células T reguladoras
Fecha
30/06/2009Registro en:
Ávalos Martínez, Claudia Estela. (2008). Estandarización de un método no radiactivo para la medición de la actividad supresora de las células T reguladoras. (Maestría en Ciencias Quimicobiológicas). Instituto Politécnico Nacional, Sección de Estudios de Posgrado e Investigación, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, México.
Autor
Ávalos Martínez, Claudia Estela
Institución
Resumen
ABSTRACT: Regulatory T cells (Treg) are essential for maintaining peripheral tolerance and they develop an important homeostatic role, controlling self-reactive cells in the periphery through cell to cell contact, expressing the high affinity alpha chain receptor for IL-2 (CD25) and the transcription factor FoxP3+; they are anergic and do not proliferate in vitro. On the other hand, spondylarthropathies (SpA) are a group of chronic degenerative rheumatic diseases, in which autoimmune nature has not been determined, although a high association with the HLA-B27*05 antigen has been shown. In patients with SpA, we have found that Treg cells are increased significantly in the synovial fluid with respect to their paired peripheral blood sample, which leads us to assume that these cells are involved in the development of the disease. Therefore, we are interested in determining its suppressive activity, which requires a sensitive and reproducible method that will allow reliable measurement of cell proliferation and tell us quantitatively the suppressor effect on proliferation of effector cells, T CD4+ CD25- (Tefec) when co-cultured in the presence of Treg. First, purification of the cell populations using magnetic columns was standardized, to obtain ≥95% purity, subsequently the optimum conditions for co-culture of cell populations under study was established. The rate of cell proliferation by the 3H thymidine incorporation method showed a considerable decrease (approximately 40%) in the co-culture compared to its positive control, and finally, to avoid the use of 3H thymidine in our laboratory, we developed and standardized the 5-bromo-2'- deoxyuridina (BrdU) method. The correlation between this method and 3H thymidine incorporation was ≥92%. Therefore, with this work we offer a standardized non-radioactive measurement of cell proliferation as an alternative that can be used in our laboratories at the Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. RESUMEN: Las células T reguladoras (Treg) son esenciales para mantener la tolerancia periférica y desarrollan una importante función homeostática, controlando a las células autoreactivas en la periferia mediante el contacto célula a célula; expresan la cadena alfa del receptor de alta afinidad para IL-2 (CD25), y el factor de transcripción FoxP3+; son anérgicas y no proliferan in vitro. Por otra parte, las espondiloartropatías (SpA) son un grupo de enfermedades reumáticas, crónico-degenerativas, de las cuales no se ha determinado su naturaleza autoinmune, aunque se ha demostrado que presentan una carga genética asociada al antígeno HLA-B27*05. En pacientes con SpA, hemos encontrado que las células Treg están aumentadas significativamente en el líquido sinovial con respecto a su muestra pareada de sangre periférica, lo cual nos lleva a suponer que estas células están involucradas en el desarrollo de la enfermedad, por lo que nos interesa determinar su actividad supresora, para esto es necesario contar con un método sensible y reproducible que permita la medición confiable de la proliferación celular e indique cuantitativamente el efecto supresor en la proliferación de las células T CD4+CD25- efectoras (Tefec), cuando son co-cultivadas en presencia de células Treg. En primer término se estandarizó la purificación de las poblaciones celulares utilizando columnas magnéticas, en donde obtuvimos un porcentaje de pureza ?95%; posteriormente, se establecieron las condiciones óptimas para co-cultivos de las poblaciones celulares en estudio; se determinó el índice de proliferación celular por el método de timidina tritiada en donde se observó una disminución considerable en los co-cultivos comparativamente con su control positivo (disminución aproximada ?40%), y finalmente, para evitar el uso de timidina tritiada en nuestro laboratorio, se desarrolló y estandarizó el método de 5-bromo-2'-deoxyuridina (BrdU). La correlación obtenida entre este método y el de incorporación de timidina tritiada fue de ?92%; por lo que este trabajo se ofrece como alternativa no radiactiva para la medición de la proliferación celular a utilizarse en la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, en donde no se contaba hasta este momento con un método estandarizado.