Impacto de las actividades agroindustriales en la reproducción de anuros (amphibia) del litoral mesopotámico de Argentina

Abstract

Las poblaciones de anfibios están en declinación y muchas de ellas han llegado a extinguirse en las últimas décadas. La intensificación y expansión de las actividades agroindustriales y la consecuente contaminaciónproducida por los productos químicos utilizados,han sido consideradascomo una de las causas responsables de este fenómeno. En este sentido, los anuros son vertebrados altamente sensibles, debido a ciertas características eco-fisiológicas, y pueden estarexpuestos a los contaminantes tanto en la fase acuática como terrestres de su ciclo de vida.La presente tesis doctoral tuvo como objetivo general,abordar mediante un estudio ecotoxicológicolos efectos de los cultivos de arroz ampliamente distribuidos en la zona del litoral mesopotámico, y de uno de los herbicidas tradicionales utilizados para su producción, sobre parámetros morfo-histológicos en órganos blanco (gónadas e hígado) en anfibios anuros. Los objetivos particulares planteados en la presente tesis fueron: O1: Evaluar la morfo-histología de gónadas e hígadoen especies de anuros adultos que co-occurren en cultivos de arroz a escala agroindustrial; O2: Evaluar los efectos letales y subletales de un herbicida con formulación 2,4-D, comúnmente usado en arrozales en renacuajos de Physalaemus albonotatus. Para cumplir el primer objetivo, se seleccionaron dos cultivos de arroz (CA) en Santa Fe (CA 1) y Chaco (CA 2); y dos sitios de referencias (Ref, áreas sin cultivos que mantienen ambientes típicos naturales representativos; Ref 1 y Ref 2),fueron seleccionados en las dos provincias,respectivamente. Se seleccionarondos especies:Lysapsus limellum (Hylidae) y Rhinella bergi(Bufonidae) queson comunes encultivos de arrozy en los sitios de referencia de ambas provincias, respectivamente. Los muestreosserealizaron durante dos periodos anuales, coincidiendo con periodo entre la siembra y cosecha del arroz. Se registraron parámetrosmorfológicos (Peso (Pe) y longitud hocico cloaca (LHC))ysecalculóel Factor de condición animal (FCA) en cada individuo. Se analizó cada individuo bajo lupa estereóscopica en búsqueda de anomalías gonadales, y en machos se calculó el volumen testicular (VT). Para viel análisis histológico de gónadas e hígadose analizaronseis individuos machos de cada sitio. Gónadas(gónadas más órgano de Bidder/OBen R. bergi),e hígadode ambas especies y sitios fueron destinados al procesamiento histológico convencional. En cada testículo se examinaron 10 túbulos seminíferos de una secciónmedial de la gónada derecha, se contabilizóel número de cistos con células en estadios tempranos, tardíos, se clasificaron de acuerdo a la cantidad de espermatozoides en el lumen en rangos (de 0 a 3), y las secciones aemás se analizaron para la identificación de alteraciones histológicas. En L. limellumse clasificó la intensidad de la pigmentación testicular en criterios que van del 0 (sin pigmento) a 3 (muy pigmentado).Para el análisis del hígado, se analizaron secciones hepáticas para cuantificar el número de melanomacrófagos (MM)y analizar las mismas en búsqueda de otras alteraciones hepáticas. Ninguno de los parámetros morfológicos (Pe, LHC, FCA, VT)resultó significativamente diferenteentre sitios en ninguna de las especies. La morfología gonadal mostró variaciones en cuanto al tamaño de ambos testículos en los individuos de sitios agrícolas, y en L. limellumse observó gran variación en cuanto a la pigmentación testicular. En tres de los individuos de R. bergicolectados en el sitio CA2se registraron anomalías en sus miembros (sindactilia y ectromelia). El análisis histológico reveló que los individuos de L. limellumdel sitio CA 1 contenían mayor proporción de cistos con células en estadios tempranos de la espermatogénesis, y una mayor proporción de túbulos con escasa o nula cantidad de espermatozoides libres en el lumen, respecto a los de Ref 1. Los individuos de R. bergide CA 2 presentaron mayor proporción de cistos con células en estadios tempranos, pero la proporción de cistos con células en estadios tardíos no difirió entre sitios. El OB de R. bergidel sitio CA 2 presentó folículos agrandados y en otro caso se observó con aspecto bilobulado. Histológicamente, se observaron células pigmentarias, folículos atrésicos y vacuolas en los folículos de especies de este sitio, pero en una proporción baja. Mediante elanálisis histológico delhígadode individuos de CA 1 y CA 2 se observóagradamiento de sinusoides, venas dilatadas, vacuolización de hepatocitos e hipervascularización deltejido hepático. El número de MM contabilizado en el tejido hepático no mostródiferencias significativas en L. limellumentre sitios (P>0.05).Sin embargo,en viiR. bergiel número de MM fue mayor en individuos de CA 2 respecto alos deRef 2 (P<0.05).Los individuos machos de las especies de anfibios anuros seleccionadas y que habitan las arroceras presentaron anomalías morfológicas en miembros, alteraciones morfológicas gonadales,ylesiones hepáticas histológicas en hígado, ausentes en los animales de los sitios de referencia. Particularmente, en L. limellumse registró una espermatogénesis alterada en comparación a lo que se observó para el sitio Ref 1.Por otra parte,para cumplir el segundo objetivo, se calculó la Concentración Letal 50 (CL50) luego de la exposición aguda de renacuajos de P. albonotatus durante 96 h a diferentes concentraciones del formulado comercial a base de 2,4-D, Amina Zamba® (350, 700, 1400 y 2400 mg/l). Además, se analizarondiferentes efectos subletales luego de la exposición crónica a cuatro concentraciones correspondientes a 12,5, 25, 50 y 75 % de la CL50 calculada a las 96 h y un control (43,7, 87,5, 175 y 262,5 mg/l de 2,4-D). Se analizaron distintas respuestas biológicas en los renacuajos: supervivencia, crecimiento(Peso (Pe); longitud total (LT), longitud hocico cloaca (LHC))y desarrollo(tiempo en alcanzar los estadios 38, 42 y la metamorfosis), anormalidades en morfología larval y alteraciones histológicas en hígado y gónadas de individuos metamórficos. LasCLs50de2,4-D Amina Zamba® a las 48, 72 y 96 h fueron1040,2, 754,2 y 360 mg/l, respectivamente. La exposición crónica al herbicida alteró la supervivencia y causóanormalidades en la morfología larval siendo las alteraciones del disco oral e intestinales las más frecuentes enlaslarvas expuestas a lasconcentraciones mayores. El crecimiento (Pe, LT, LHC) de las larvas no reveló diferencias significativas entre los tratamientos(P>0.05).Los renacuajos expuestos a 2,4-D mostraron una aceleraciónen el desarrollo, alcanzando losestadios38 y 42 ylametamorfosis significativamente antes que los individuos del control. El análisis histológico de hígado demostró que en los renacuajos expuestos a 87,5, 175 y 262,5 mg/l de 2,4-D hubo un incremento significativo en el número de MM respecto al control(P<0.05).Además, se observó vacuolización dehepatocitos, agrandamiento de sinusoides ydilatación de vasos sanguíneosen los viiiindividuos tratados. No se observaron alteraciones histológicas en testículos de renacuajos de P. albonotatusexpuestos al herbicida2,4-D. Por el contrario, el examen histológico de los ovarios de individuos tratados con las mayores concentraciones de 2,4-D Amina Zamba® (175, 262,5 mg/l) mostróun estado de desarrollo más retrasado respecto al control yalas menores concentraciones.El herbicida a base del formulado 2,4-D(Amina Zamba®)causó unefecto letal agudobajosobrerenacuajos de P.albonotatus, especie para la cual no existían evidencias sobre los efectos tóxicos de la exposición aguda y crónica a este agroquímico de uso masivo. Asimismo, se registraron anormalidades morfológicas severas, aceleración eneltiempo de desarrollo morfológico, retraso en desarrollo ováricoy proliferación de melanomacrófagos hepáticos porexposición a concentraciones altas de este herbicida. Estos marcadores biológicos deberían ser evaluados en futuros estudios para comprender los mecanismos que subyacen a estos efectos. Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos, se pudieron sostener las hipótesis planteadas en el capítulo I: Los productos agroquímicos utilizados en los cultivos de arroz producen alteraciones en la morfo-histología gonadal en anfibiosanuros adultos y causan histopatologías hepáticas por exposición crónicaenL. limellum yR. bergi.El formulado comercial 2,4-D Amina Zamba® altera el desarrollo, morfología e histología gonadal enrenacuajos de P. albonotatus. La exposición crónica a concentraciones subletales del formulado comercial 2,4-D Amina Zamba® causa alteraciones histopatológicas en eltejidohepáticoen renacuajos de P. albonotatus.La información obtenida en relación a los efectos de las actividades agrícolasy la aplicación de plaguicidas, brindaevidencias del riesgo ecotoxicológico al que están expuestos los anfibios anurosen los cultivos de arroz en lasprovinciasde Santa Fe yChaco.

The amphibian populations are in decline, and many of them have become extinct in recent decades. The intensification and expansion of agro-industrial activities and the agrochemicals contamination have considered one of the main causes that operate on this phenomenon. In this sense, the anurans are highly sensitive vertebrate, dueto certain eco-physiological characteristics, and may be exposed to pollutants both in aquatic and terrestrial phases of their life cycle.The general aim of this doctoral thesis was to study the effects of rice crops andtraditional herbicides used for its production on morphological and histological parameters oforgans (gonads, liver) ofanurans through an ecotoxicological study. The specific goals were: O1: To evaluatethe morphology and histology of gonads and livers of two adult anurans species that co-occur in rice crops. O2: To evaluatethe lethal and sublethal effects of a 2,4-D herbicide formulation, commonly used in rice fields in Physalaemus albonotatus tadpoles.For the first purpose, two rice crops (RC) from Santa Fe(RC 1)province and Chaco(RC 2)province; and two reference sites (Ref, areas without crops that maintain typical representative natural environment; Ref1 and Ref2) were selectedin the two provinces, respectively. Two anuran species were selected: Lysapsus limellum(Hylidae) and Rhinella bergi(Bufonidae) that are commonly found in the rice crops and reference sites of both provinces, respectively. The field surveys were carried out during two annual periods, coinciding totime between rice planting and harvesting. The weight(We) and snout-vent length(SVL)were measured, and the animal condition factor(CF)werecalculated for each individual. The analysis of the gonadal morphology was performed under stereoscopic magnifying glasses and the testicular volume(TV)was calculated. Six male individuals from each site were selected for histological analysis of gonad and liver.Standard histological proceduresof gonads (gonads and Bidder organ/BO in R. bergi) and livers of both species wereperformed. Ten seminiferous tubules of amedial section of the right testes were examined, the number of cysts with early stages, late stages of spermatogenic cells was xicounted, and the amount of sperm in the lumen was stages from 0 to 3. In addition, all the sections were analyzed to score histological alterations. The intensity of testicular pigmentation was classified ranging from 0 to 3 criteria. For liver histological analysis, the number of melanomacrophages (MM)was quantified in the hepatic sections and other histological alterations weresearched. None of the morphological parameters(We, SVL, FC, and TV)wassignificantly different between sites in any of the species. The gonadal morphology showed irregular sizes between both testes in agricultural sites, and a great variation in the testicular pigmentation was also observedin L. limellum. Limb abnormalities (syndactyly and ectromelia) were observed in three R. bergiindividuals from RC 2. In L. limellumfrom RC 1, the histological analysis revealed a higher proportion of cysts with early spermatogenic cell stages and a greater proportion of seminiferous tubules without orlittle amount of free spermatozoa, thanRef 1. Rhinella bergifrom RC 2 had a higher proportion of cysts with early spermatogenic cell stages than in Ref 2, but the proportion of cysts with late spermatogenic stages did not differbetween sites. The BO of R. bergifrom RC 2presented enlarged follicles and a bilobed appearance. Furthermore, pigmentary cells, atretic follicles, and vacuoles in follicles were observed through histological analysis, but in low proportion. Sinusoid enlargement, dilated veins, hepatocyte vacuolization and hypervascularization in frogs liver tissue from agricultural sites were observed by histological analysis. The MM number did not showsignificant differences in L. limellum between sites (P>0.05).However, the MM number was higher in R. bergifrom RC 2 than Ref 2 (P<0.05).The male individuals of the selected anuran that inhabit the rice fields presented morphological abnormalities in limbs, gonadal morphological alterations, and histological hepatic injuries. InL. limellum altered spermatogenesis was recorded compared to individuals of Ref 1. For the second purpose, the Lethal concentration 50 (LC50) was calculated after the acute exposure for 96 h at different concentrations of 2,4-D Amina Zamba® (350, 700, 1400 and 2400 mg/l). The sub-lethal effects were evaluated after chronic exposure to four concentrations corresponding to 12.5, 25, 50 and 75% of the LC5096h and control (43.7, 87.5, 175and 262.5 mg/l xii2,4-D). The different biological responses analyzed were: survival, growth(Weight (We), total length (TL), snout-vent length (SVL))and development (time to reach the 38 and 42 stages and metamorphosis), abnormalities in larval morphology and histological abnormalities in liver and gonads in metamorphic individuals. The LCs50 for 2,4-D Amina Zamba® at 48, 72 and 96 h were 1040.2, 754.2 and 360 mg/l, respectively. The chronic exposure to the herbicide altered long-term survival, caused larval morphology abnormalities being the oral and intestinal disc the most frequent malformation atthe highest concentrations. The growth (We, TL and, SVL) of the tadpoles did not showsignificant differencesbetween treatments (P>0.05).Tadpoles exposed to 2,4-D showed an acceleration in development, reaching the 38 and 42 stages and metamorphosis significantly before controls. A significant increase inthe number of MM was observed in the hepatic tissue of tadpoles exposed to 87.5, 175 and 262.5 mg/l of 2,4-D compared to the control (P<0.05). In addition, hepatocyte vacuolization, enlargement of sinusoid and blood vessel dilation were observed in treated tadpoles. No histological alteration was observed in P. albonotatus testes of tadpoles exposed to the herbicide. By contrast, the ovaries of individuals treated with the highest concentrations (175, 262.5 mg/l) of 2,4-D Amina Zamba® showed a delay in ovarian development compared to control and lowerconcentrations.The 2,4-D herbicide formulation had a low acute lethal effect on tadpoles of P. albonotatus, a species for which there was no evidence on the toxic effects of acute and chronic exposure to this agrochemical. Based on the results of the laboratory-scale bioassays, severe morphological abnormalities, acceleration in morphological development time, delayed ovarian development, and hepatic melanomacrophage proliferation before exposure to high concentrations of this herbicide were recorded. These biological markers should be evaluated in future studies tounderstand the mechanisms that underlie these effects. Finally, the hypotheses raised in chapter one have been sustainedwith the result obtained here: xiiiThe agrochemicals used in rice crops producedalterations in gonadal morphology and histology in adult anuran amphibians and causedhisto-pathologies after chronic exposures in L. limellumand R. bergiadults. The commercial formulation 2,4-D Amina Zamba® alteredthe development, morphology and gonadal histology of P. albonotatustadpoles. Chronic exposure to commercial formulation 2,4-D Amina Zamba® producedhistopathological alterations in hepatic tissues of P. albonotatustadpoles.The data obtained regarding the effects of the agricultural activities and the applications of pesticides provide evidence of the ecotoxicological risk that hasbeen exposed amphibiansin rice crops from Santa Fe and Chaco Provinces.