Evaluación de estrategias para la producción de proteínas recombinantes solubles de Plasmodium falciparum, en un sistema procariote

Abstract

La malaria es la enfermedad parasitaria con el mayor número de casos clínicos y muertes reportadas al año, causados principalmente por Plasmodium falciparum, una de las cinco especies que infecta a humanos. Diversas estrategias de control se han implementado para combatir la enfermedad, desde el desarrollo de campañas de educación para evitar la transmisión, hasta el uso de insecticidas y medicamentos contra el vector y el parásito. En miras de desarrollar nuevas estrategias para bloquear la enfermedad, la invasión del parásito al glóbulo rojo ha despertado gran interés en los últimos años, proceso que es llevado a cabo por un complejo de proteínas denominado Glideosoma, que incluye, entre otras proteínas, un motor actina-miosina. Hasta la fecha se han identificado seis miosinas en P. falciparum y solo una de ellas (PfMyoA) ha sido caracterizada como participante activa en el Glideosoma; sin embargo, resultados previos de nuestro laboratorio acompañan la idea de que otra miosina del parásito posiblemente participa en el proceso de invasión. Para retar dicha hipótesis es necesaria la evaluación de interacciones entre todas las proteínas del Glideosoma y la miosina candidata, para lo cual obtener el repertorio completo de las proteínas es imperativo; de esta manera, la producción de proteínas recombinantes se convierte en la estrategia molecular de elección. Sin embargo, la obtención de proteínas recombinantes solubles de P. falciparum es un desafío, debido a características muy particulares en el genoma del parásito. El objetivo de este trabajo fue evaluar estrategias que permitieran la obtención de proteínas recombinantes solubles, bien sea a partir de la expresión soluble o de la recuperación a partir de cuerpos de inclusión, sin la adición de agentes caotrópicos para la solubilización. Adicionalmente, con el fin de conocer si el genoma de P. falciparum tenía más miosinas (diferentes a las ya descritas) se hizo un análisis bioinformático para la búsqueda de nuevas secuencias. Por otro lado, se realizó una comparación de estructuras terciarias entre PfMyoA y nuestro candidato a homólogo funcional (PfMyoB), para lo cual la identificación de similitudes entre las estructuras, soportaría dicha hipótesis. Los resultados obtenidos en la inducción de la expresión soluble, indicaron que ninguno de los parámetros evaluados en la inducción, como temperatura, concentración de IPTG y densidad óptica (DO), tuvo efecto en la solubilidad de las proteínas recombinantes rPfMyoB y rPfGAP50. Sorprendentemente, el uso de vectores con secuencias fusión y bacterias modificadas para la optimización de la traducción y plegamiento, tampoco ofrecieron ventajas significativas sobre la solubilidad, pues solo un poco de expresión soluble se obtuvo con la combinación del vector pMAL y las bacterias chaperonas; sin embargo, la mayoría de la proteína recombinante se concentró junto con los cuerpos de inclusión; por consiguiente nuestros resultados sugieren que la marcada insolubilidad de las recombinantes producidas, está influenciada por características propias de la secuencia proteica (aún no establecidas) y no a condiciones en la inducción de la expresión. Teniendo en cuenta que las recombinantes siempre se expresaron como proteínas insolubles, se desarrolló una estrategia de electro elusión para la recuperación de recombinantes solubles de P. falciparum desde cuerpos de inclusión. Adicionalmente, con base en la comparación de los resultados en la predicción de solubilidad de programas bioinformáticos y los obtenidos experimentalmente, se concluye que la única manera de conocer el comportamiento soluble de las proteínas recombinantes de P. falciparum producidas en Escherichia coli, es mediante el desarrollo experimental.