3. Analizar la Capacidad Infectiva de las Cepas Bacterianas Obtenidas mediante Ensayos de Infección In-vitro e In-vivo para Confirmar su Atenuación y Estabilidad en Dichos Modelos. Este Objetivo Consiste en Demostrar que las Cepas Bacterianas Atenuadas Obtenidas No Son Capaces de Desarrollar la Enfermedad en los Diversos Modelos In-vitro e In-vivo Estudiados. Se Espera que las Variantes Obtenidas No Produzcan Efectos Citopáticos al Infectar Cultivos Celulares (pruebas In-vitro) para Luego Realizar Dichas Pruebas Utilizando Peces en Condiciones Controladas (pruebas In-vivo) en donde se Espera que las Cepas Obtenidas No Desarrollen el Cuadro Clínico Ni Mortalidades Atribuibles a Srs en Salmones. Adicionalmente se Confirmará que las Variantes Obtenidas No Son Capaces de Revertir a Variantes Virulentas Luego de Diversos Pasajes Infectando Cultivos Celulares.Analizar los Resultados Obtenidos y en Base a ellos Diseñar la Estrategia de Protección mediante Herramientas de Propiedad Intelectual Especialmente Patentes de Invención para su Apropiación por Parte de la Empresa. Este Objetivo Consiste en Recopilar Toda Información Relativa a la Ejecución de las Actividades del Proyecto y Analizar los Resultados Obtenidos. Además en Base a los Resultados Obtenidos se Diseñará la Estrategia de Protección de Dichos Resultados mediante Herramientas de Propiedad Intelectual Especialmente Patentes de Invención y Secreto Empresarial.Caracterizar al Menos 10 Genes de la Bacteria P. Salmonis Implicados en el Establecimiento del Síndrome Rickettsial del Salmón (srs) mediante Análisis de Expresión Génica Diferencial de Última Generación (ngs) para Ser Modificados mediante Sistemas de Edición Génica. Este Objetivo Consiste en el Análisis de Expresión de Genes (transcriptómico) de la Bacteria P. Salmonis y su Comparación bajo Diversas Condiciones de Crecimiento y durante el Proceso de Infección de Salmones lo que Nos Permitirá Identificar Genes Implicados en la Virulencia de Dicha Bacteria Determinando Posibles Blancos de Edición Génica para la Obtención de Cepas Atenuadas de P. Salmonis.Desarrollar un Prototipo Experimental de Vacuna Oral Efectivo contra el Srs Basado en Cepas Vivas Atenuadas de Piscirickettsia Salmonis Obtenidas mediante Edición Genómica Dirigida a Partir del Análisis de Expresión Génica Diferencial de una Cepa Virulenta durante Ensayos de Infección en Salmones. Para Llevar a Cabo esto en una Primera Etapa se Identificarán Aquellos Genes que se Expresan Diferencialmente en la Bacteria P. Salmonis en Diferentes Condiciones Creciendo en Medio Libre de Células Infectando Cultivos de Células de Salmón e Infectando Salmones mediante Técnicas de Secuenciación Masiva de Última Generación (ngs). Paralelamente se Desarrollará un Procedimiento para Llevar a Cabo la Transformación Genética de la Bacteria lo que es Necesario para Aplicar el Sistema de Edición Génica Crispr-cas9 mediante el cual se Modificarán Aquellos Genes de la Bacteria Identificados como Claves para Llevar a Cabo el Proceso de Infección en Salmones (factores de Virulencia). Una Vez Realizado esto mediante Ensayos de Expresión Génica se Confirmará que la Edición Génica se Llevó a Cabo Exitosamente y que por lo Tanto se Habrían Obtenido Cepas Vivas Atenuadas con una Capacidad de Infección Reducida lo que se Confirmará mediante Ensayos de Infección en Cultivos de Células de Salmón y Posteriormente Infectando Salmones con Dichas Cepas Bacterianas. Una Vez Seleccionadas Aquellas Cepas de Bacterias con Capacidad de Infección Reducida (atenuadas) en Salmones se Formularán Prototipos de Vacunas Orales Vivas Atenuadas para Evaluar su Seguridad y Eficacia mediante Ensayos de Vacunación y Posterior Desafío en Salmones. A Medida que se Vayan Obteniendo Resultados Exitosos Intermedios y Finales se Establecerá la Mejor Estrategia de Protección de Dichos Resultados mediante Herramientas de Propiedad Intelectual como Patentes de Invención y Secretos Empresariales.Modificar mediante Sistemas de Edición Génica los Genes de Virulencia de la Bacteria P. Salmonis Previamente Identificados para Obtener Cultivos Bacterianos con una Capacidad de Infección Reducida. Este Objetivo Consiste en el Desarrollo e Implementación de un Protocolo para la Edición de los Genes de Virulencia de P. Salmonis Previamente Identificados que Permita Obtener Cepas Bacterianas con Capacidad de Infección Reducida (atenuadas).El Síndrome Rickettsial del Salmón (srs) es una Enfermedad que Afecta a Especies Salmonídeas de Cultivo Intensivo como Salmón del Atlántico (salmo Salar) Trucha Arcoiris (onchorynchus Mykiss) y Salmón del Pacífico o Salmón Coho (onchorynchus Kisutch) Fue Descrita por Primera Vez en Chile el Año 1989 y desde Entonces Corresponde a la Enfermedad Bacteriana que Reporta las Mayores Pérdidas a la Industria Salmonicultora Nacional. La Bacteria Piscirickettsia Salmonis Corresponde al Agente Etiológico Causante de la Enfermedad Recientemente se ha Clasificado en al Menos Dos Genogrupos Diferentes y ha Sido Ampliamente Estudiada desde un Enfoque Epidemiológico Pero Aún Falta Mucho por Conocer Respecto de los Mecanismos Involucrados en el Proceso de Infección y Establecimiento de la Enfermedad. Farmacología en Aquacultura Veterinaria Fav S. A. Ha Dirigido sus Esfuerzos a Desarrollar una Vacuna Eficaz contra el Srs Basándose en el Estudio en Profundidad de los Procesos Bioquímicosmoleculares que Ocurren durante el Establecimiento de la Enfermedad. Para lo que ha Establecido un Contrato de Investigación y Desarrollo con el Centro Interdisciplinario de Investigación en Acuicultura (incar) de la Universidad de Concepción quien Cuenta con una Vasta Experiencia en Ensayos Genómicos de Última Generación de Patógenos de Especies Salmonídeas con Quienes se Trabajará Estrechamente en Elucidar los Diferentes Mecanismos Moleculares del Establecimiento de la Enfermedad Srs en Salmones lo que Considerará Unir las Capacidades en Análisis Genómicos del Incar con la Experiencia de Fav en el Desarrollo de Productos Inmunológicos para la Industria Salmonicultora. El Objetivo Principal de nuestro Proyecto es Desarrollar un Prototipo de Vacuna Viva Atenuada Oral Eficaz para el Control de Srs en Mar que Permita Inducir una Respuesta Inmune Protectora Sistémica y Mucosal en los Peces Vacunados con el Fin de Lograr una Terapia Efectiva y de Largo Plazo. Asimismo Esta Nueva Estrategia Busca Disminuir las Mayores Pérdidas que Sufre la Industria esto es en Peces que ya Han Sido Trasladados al Mar en los Cuales la Eficacia de las Vacunas Inyectables ha Disminuido Notablemente y que se Encuentran Más Susceptibles a Generar un Cuadro Severo de Srs. Lo que a su Vez Permitirá Disminuir el Uso Excesivo de Fármacos Evitando de Esta Manera la Generación de Resistencia a Antibióticos que se ha Evidenciado hasta Ahora y Disminuyendo el Impacto Ambiental Generado por la Industria. Durante el Proyecto se Identificarán Genes Claves en el Proceso del Establecimiento del Síndrome Rickettsial del Salmón (srs) mediante el Estudio de la Expresión Génica Diferencial de la Bacteria durante el Proceso de Infección en Salmones. Posteriormente se Llevarán a Cabo Ensayos de Edición Génica en Cultivos de la Bacteria para Modificar Selectivamente Dichos Genes y de Esta Manera Obtener Cepas Bacterianas con Capacidad de Infección Reducida (atenuadas) lo que Será Confirmado Tanto mediante Estudios Invitro Infectando Cultivos de Células de Salmón como In-vivo Infectando Salmones en Condiciones Controladas. Una Vez se Obtengan Resultados Favorables para Uno o Más Genes se Procederá a Formular Prototipos de Vacunas Orales Utilizando las Cepas de Bacterias Vivas Atenuadas Obtenidas para Evaluar su Seguridad y Eficacia mediante Ensayos de Vacunación y Desafío de Salmones con Cepas Virulentas de P. Salmonis.Corporación de Fomento de la Producción