Ajustar un Protocolo que Permita la Extracción de Suficiente Cantidad de Arn de Calidad de Lilium y Viral. El Genoma de los Virus que se Desea Analizar Esta Compuesto por Arn por lo que se Debe Extraer desde los Tejidos de Interés este Tipo de Molécula se Probarán 3 Sistemas de Extracción.Ajustar el Protocolo de Retrotranscripción de Arn a C-adn. La Reaccion en Cadena de la Polimerasa Permite Amplificar Segmentos de Adn y No de Arn por lo cual es Necesario Hacer una Etapa de Sintesis de Adn Complementario a Partir del Rna Extraido.Diseñar y Probar Partidores y Sondas del Tipo Taq-man Específicos para los Virus Lmov Armv Lsv y Plamv. Se Hará Búsqueda de Genomas e Información Genética de Cada Virus en la Base de Datos Ncbi y mediante Softwares se Diseñan Partidores y Sondas los que Serán Sintetizados y Ensayados.El Objetivo General del Proyecto es Desarrollar el Procedimiento de Diagnóstico de 4 Virus (lmov Armv Lsv y Plamv ) que Afectan a Lilium Sp. Mediante Pcr en Tiempo Real. El Sistema de Análisis Consta de Varias Etapas. En Primera Instancia se Debe Lograr la Eficiente Extracción de Arn de la Planta y Viral a Partir de Diversos Tejidos de la Planta: Bulbos de Campo Bulbos de Iniciación Hojas de Cultivo In Vitro Hojas de Campo. En Segunda Instancia se Debe Lograr la Síntesis de C-dna a Partir del Arn mediante una Retrotranscripción (rt). El Producto de la Rt es Utilizado Entonces para Realizar el Pcr en Tiempo Real. En Paralelo a Estas Actividades se Debe Realizar la Etapa de Diseño de Partidores y Sondas Marcadas con Fluorocrómos Específicos a Cada Virus los Cuales Serán Utilizados en Pcr en Tiempo Real. Finalmente se Procederá a Estandarizar y Validar la Nueva Técnica Respecto de la Conocida Das-elisa.Estandarizar y Validar los Resultados Obtenidos con Pcr en Tiempo Real con los Resultados Obtenidos mediante la Técnica de Das-elisa. Una Vez Probados los Partidores y Sondas se Procederá a Validar el Nuevo Método de Diagnóstico en Comparación con el Sistema de Das-elisa.Chile es el Principal Exportador de Bulbos Ornamentales del Hemisferio Sur y el Cuarto a Nivel Mundial. Del Total de Bulbos Exportados desde el País el 87% Corresponde a Bulbos de Lilium Sp. La Producción de Esta Especie se Concentra en las Regiones de Bio-bio y los Lagos Además de Encontrarse Algunas Explotaciones Menores en la Región de Valparaíso. La Producción Nacional es Subcontratada por Empresas Holandesas Quienes Solicitan Servicios de Multiplicación o Simplemente Licencian Variedades. Ya que el Principal Objetivo de la Producción de Bulbos de Lilium es la Exportación el Material Debe Ser Mantenido bajo un Estricto Control de su Estado Sanitario. El Procedimiento para la Producción de Flores de Lilium para Flor de Corte Ó para Macetas Comienza con los Programas de Mejoramiento Genético Continua con una Fase de Multiplicación In Vitro y Luego por 2 Temporadas de Engorda de los Bulbos en Campo para Finalmente Llegar al Productor de Flores al Cuarto Año. Lamentablemente las Principales Enfermedades Virosas No Presentan Síntomas en las Primeras Etapas del Cultivo y Solo Son Detectadas Visualmente durante la Etapa Productiva del Cultivo (cuarto Año) Implicando Grandes Pérdidas Económicas y de Credibilidad para las Empresas Productoras de Bulbos. Por ello se Hacen Grandes Esfuerzos en el Saneamiento del Material Vegetal que es Utilizado en Propagación y en la Detección Temprana de las Infecciones. Hoy en Día el Organismo Encargado de Certificar la Producción y Autorizar las Exportaciones es el Servicio Agrícola y Ganadero mediante Test Das-elisa. Esta Detección es Tardía ya que se Realiza Justo al Momento de Exportar lo que Implica Rechazo de Lotes en Caso de Encontrar el Virus Testeado. La Técnica de Das-elisa es Lenta de Aplicar Produce Cierta Cantidad de Resultados Falsos Positivos los Costos de su Aplicación Han Ido en Aumento y es Cada Vez Más Criticada por el Entorno ya que los Anticuerpos Utilizados se Elaboran a Partir de Plasma Animal. La Empresa Smrl Aplica este Tipo de Diagnóstico Hace Varios Años ya en Toda la Cadena Productiva Iniciaciones Etapa de Multiplicación y Entregas Realizando de 3. 000 a 4. 000 Tests/año. Debido a las Limitaciones de Esta Técnica (incidencia de Falsos Positivos Y/o Falsos Negativos Sensibilidad de Detección y Tiempo de Análisis) los Productores de Nacionales de Bulbos Han Complementado el Diagnostico por Das-elisa en Puntos Clave de la Cadena Productiva con el Testeo con Pcr en Tiempo Real en el Extranjero Principalmente Holanda. La Técnica de Detección de Virus mediante Pcr en Tiempo Real es Ampliamente Utilizada y ha Sido Probada en Chile y el Mundo para Diagnosticar Enfermedades en Humanos Animales y Plantas. La Técnica Consiste en la Detección de Alguna Zona del Genoma Viral mediante Amplificación y Detección del Fragmento con el Equipo de Pcr en Tiempo Real. Para ello se Diseñan Partidores Específicos del Virus que Permiten la Amplificación del Genoma Viral y de una Sonda Marcada con Fluoróforos que Permitirá la Detección y Evaluación del Proceso de Amplificación a Medida que Ocurre. Los Beneficios del Uso de Esta Técnica Son la Detección del Patógeno Debido al Monitoreo en Vivo del Proceso de Amplificación del Genoma Viral Determinación del Nivel de Infección Identificación del Fragmento Amplificado mediante High Resolution Melting Mayor Sensibilidad Técnica Precisión y Eficiencia Además de Disminuir los Riesgos de Contaminación Cruzada. Existen Dos Empresas en Países Bajos que Prestan el Servicio de Diagnóstico mediante Pcr en Tiempo Real lo que Impone Complicaciones Operacionales y Técnicas al Proceso de Testeo como Son el Despacho de las Muestras al Extranjero Barreras Sanitarias y Legales para el Envío (inspección Sag) Deterioro de las Muestras Debido al Viaje Largos Tiempos de Análisis Incapacidad de Repetir o Cuestionar los Resultados y Falta de un Servicio Holístico que Ayude a la Toma de Decisiones. En este Sentido Sociedad Agrícola Catapilco Ltda quien Actualmente Posee un Programa de Mejoramiento Genético de Lilium Requiere Diseñar un Sistema de Testeo que Asegure la Calidad Sanitaria de los Materiales Usados y de las Selecciones Avanzadas Liberadas del Programa Facilitando la Posterior Multiplicación de las Variedades Obtenidas. Por Otra Parte Sone Mericrom &amp, Research Laboratory S. A. Empresa Líder en la Propagación In Vitro de Lilium a Nivel Latinoamericano quien Además Apoya el Proceso de Mejoramiento de Lilium Ejecutado por Agrícola Catapilco se Encuentra Trabajando en la Determinación Varietal Especies Frutales a Través de Técnicas Moleculares Contando con el Personal Técnico e Instalaciones Necesarias para Desarrollar Técnicas de Detección de Virus a Través de Rt-pcr en Tiempo Real. Es por esto que Ambas Empresas se Han Unido para Llevar a Cabo este Proyecto que los Beneficiará a ellos y a Todas las Empresas Productoras de Bulbos del País.Corporación de Fomento de la Producción