Metabolomic tools for chemosystematic studies and identification of bioactive natural products in Malpighiaceae species

Abstract

Historically, plants are among the most investigated sources of natural products, which substantially contributed to the development of the natural products field. Plant metabolites represent a rich structural diversity, with countless biological activities that have inspired the development of several drugs. Brazil is considered a megadiverse hotspot, containing thousands of species without any chemical information reported to date, representing a vast potential for chemical studies. The continuous development of natural product bioinformatics tools and databases can be of great value to assist and accelerate studies in the natural products field in Brazil. In this context, the Malpighiaceae botanical family stands out for presenting a wide diversity of natural products reported to date, but still containing hundreds of chemically underexplored species. This research aims to study plant species from the Malpighiaceae family, with three main objectives: (1) develop an optimized chromatographic method (UHPLC- PDA) for the analysis of a mixture of extracts from Malpighiaceae species (MIX); (2) perform a chemosystematic investigation based on UHPLC-MS/MS analysis of 137 Malpighiaceae species based on MS/MS untargeted metabolomics, spectral searches, and recently described in silico classification tools; (3) search for bioactive compounds with larvicidal activity against Aedes aegypti using an untargeted metabolomics approach. The results obtained highlight the power of using the Quality by Design approach to develop a robust chromatographic method of very complex samples, as well as of the Molecular Networking tool, which led to the successful annotation of 61 compounds in the nine extracts used to prepare the MIX. In addition, the bioinformatics tools used in the chemotaxonomic investigations revealed several clade or genera- specific chemical classes, which were successfully used to reconstruct the Malpighiaceae phylogeny. This analysis provided classes of metabolites identified as homoplastic (i.e., non-exclusive) or synapomorphic (i.e., exclusive) for clades and genera, and allowed a comprehensive evolutionary chemical study in Malpighiaceae. Finally, for the search of bioactive compounds, an initial screening revealed Heteropterys umbellata as the most promising species, which was selected for a deeper chemical investigation. It was possible to determine the differences in the metabolic profiles of stems and leaves, and of collections performed in different states in the Cerrado biome (Minas Gerais and São Paulo). A bio-guided fractionation led to the isolation of nitropropanoyl glucosides, an unusual class of metabolites that showed moderate to potent larvicidal activity. In conclusion, this study contributed to investigate the chemistry of dozens of Malpighiaceae species which had not been investigated to date. It allowed the inspection of the chemical classes in Malpighiaceae in a chemoevolutionary context, besides leading to the isolation of unusual natural compounds by a metabolomic-based approach. These results contributed to expand the chemical knowledge of Malpighiaceae, and the workflows followed can be reproduced in other taxa for further chemical investigations.

Historicamente, as plantas estão entre as fontes de produtos naturais mais investigadas, e contribuíram significativamente para o desenvolvimento do campo da química de produtos naturais. Metabólitos de plantas representam uma diversidade estrutural rica, com inúmeras atividades biológicas que inspiraram o desenvolvimento de diversos fármacos. O Brasil é considerado um hotspot de biodiversidade contendo milhares de espécies sem nenhuma informação química relatada até o momento, representando um vasto potencial para estudos químicos. O desenvolvimento contínuo de ferramentas e bancos de dados de bioinformática de produtos naturais pode ser de grande valia para auxiliar e acelerar estudos na área de produtos naturais no Brasil. Nesse contexto, a família botânica Malpighiaceae se destaca por apresentar uma grande diversidade de produtos naturais reportados na literatura, e ainda contém centenas de espécies quimicamente inexploradas. O presente trabalho tem como objetivo estudar plantas da família Malpighiaceae, com três principais objetivos: (1) desenvolver um método cromatográfico otimizado (em UHPLC-PDA) para análise de uma mistura de extratos de espécies da família Malpighiaceae (MIX); (2) realizar um estudo quimiossistemático baseado em análises de UHPLC-MS/MS de 137 espécies de Malpighiaceae baseado em metabolômica não direcionada, buscas espectrais, e em ferramentas de classificação in silico recentemente descritas; (3) buscar por compostos bioativos com atividade larvicida contra o Aedes aegypti usando uma abordagem metabolômica. Os resultados obtidos destacam o poder do uso da abordagem Quality by Design para desenvolver um método cromatográfico robusto de amostras muito complexas, além do uso da ferramenta Molecular Networking, que levou à anotação bem-sucedida de 61 compostos nos nove extratos usados para preparar o MIX. Além disso, as ferramentas bioinformáticas utilizadas nas investigações quimiotaxonômicas revelaram diversas classes químicas específicas de determinados clados ou gêneros, e foram usados para reconstruir a filogenia de Malpighiaceae. Esta análise forneceu classes de metabólitos identificados como homoplásticos (ou seja, não exclusivos) ou sinapomórficos (ou seja, exclusivos) para clados e gêneros, e permitiu um estudo químico evolutivo abrangente em Malpighiaceae. Finalmente, para a busca de compostos bioativos, uma triagem inicial revelou a espécie Heteropterys umbellata como a mais promissora, que foi selecionada para uma investigação química mais aprofundada. Foi possível determinar as diferenças nos perfis metabólicos de caules e folhas e de coletas realizadas em diferentes estados do bioma Cerrado (Minas Gerais e São Paulo). Um fracionamento bioguiado levou ao isolamento de nitropropanoil glicosídeos, uma classe incomum de metabólitos que apresentaram atividade larvicida de moderada a potente. Em conclusão, este estudo contribuiu para investigar a química de dezenas de espécies de Malpighiaceae que ainda não haviam sido estudadas até então. O estudo permitiu a análise das classes químicas em Malpighiaceae em um contexto quimioevolutivo, além de levar ao isolamento de compostos naturais incomuns por uma abordagem de base metabolômica. Esses resultados contribuíram para ampliar o conhecimento químico sobre Malpighiaceae, e os fluxos de trabalho seguidos podem ser reproduzidos em outros táxons para futuras investigações químicas.