Production of carotenoids by yeast Rhodotorula glutinis CCT-2186 and their extraction using alternative solvents

Abstract

This thesis consists of the investigation and optimization of sustainable strategies to enhance carotenoids production from yeast Rhodotorula glutinis CCT- 2186 (R. glutinis) and their extraction by means of ionic liquids (ILs) and bio-based solvents. The interest on carotenoids such as β-carotene, torulene and torularhodin relies on the plethora of relevant properties of these products and their commercial value for food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries. However, to make carotenoids more accessible in a sustainable way, their production from microbial sources is of paramount importance. Concerning the production of carotenoids from R. glutinis yeast there are still processual challenges, such as the improvement of production yields and development of efficient and sustainable extraction platforms. Initially, different statistical experimental designs were applied to improve carotenoids production and the best bioprocess was scaled-up to a 5 L stirred-tank bioreactor. Since the carotenoids are produced intracellularly, requiring appropriate cell-disrupting and extraction methodologies for their recovery, subsequently, the development of more benign and effective extraction/purification platforms was evaluated. A comprehensive study using aqueous solutions of ionic liquids (ILs) for solid-liquid extraction (SLE) processes was carried out, following the carotenoids purification using a three-phase partitioning system composed of aqueous solutions of ILs and inorganic salts. To gather additional information on the phase separation mechanisms, aqueous biphasic systems (ABS) composed of ILs and inorganic salts were determined and characterized. Afterward, the potential of bio-based solvents was evaluated, with the purpose of designing a more efficient and ecofriendly extraction process for recovery of the intracellular carotenoids from R. glutinis. In this study it was designed and optimized an integrated downstream platform using a ternary mixture of bio-based solvents (ethyl acetate/ethanol/water) with isolation and polishing of carotenoids as well as the recycling of the solvents. The overall sustainability of the proposed technology was assessed in terms of solvents recyclability and carotenoids polishing, and the environmental impact of the platform through a life cycle assessment (carbon footprint). This thesis demonstrates the importance of combined organic and inorganic nitrogen sources to supplement the nutritional media for cultivation of R. glutinis and production of carotenoids, and that ILs and mixed bio-based solvents can be used to design simple, efficient and sustainable platforms for the recovery of intracellular carotenoids from microbial biomass.

A crescente busca por produtos naturais e os desafios de sua produção industrial, tem motivado pesquisadores a investigar estratégias para o incremento da produção a partir de fontes microbianas e o desenvolvimento de procedimentos sustentáveis e eficientes para a sua extração. Os carotenoides naturais como o β-caroteno, toruleno e torularodina além de serem poderosos antioxidantes naturais, são corantes que vem merecendo destaque devido às suas propriedades biológicas com aplicações relevantes nas indústrias alimentar, cosmética e farmacêutica. No presente trabalho estudou-se um processo integrado que engloba o cultivo da levedura Rhodotorula glutinis CCT- 2186 (R. glutinis) para o incremento da produção de carotenoides e a extração destes produtos empregando líquidos iónicos (LIs) e bio-solventes como solventes alternativos. Inicialmente, diferentes planejamentos fatoriais foram aplicados para incrementar a produção de carotenoides e para a melhor condição foi realizado um aumento de escala em biorreator de 5 L. Posteriormente, estudos usando soluções aquosas de LIs em processos de extração sólido-líquido foram realizados, seguidos pelo processo de purificação empregando um sistema de partição trifásico composto por soluções aquosas de LIs e sais inorgânicos. Para reunir informações adicionais sobre os mecanismos de separação das fases, sistemas aquosos bifásicos (SAB) compostos por LIs e sais inorgânicos foram determinados e caracterizados. O potencial dos bio-solventes para a recuperação de carotenoides de células de R. glutinis foram também avaliados, a fim de se obter um processo de extração/purificação sustentável, mais eficiente e ecologicamente correto. Este último estudo permitiu a compreensão e otimização de uma abordagem downstream sustentável para a extração usando misturas ternárias (acetato de etilo/etanol/água) com posterior isolamento e polimento de carotenoides, e reciclagem dos solventes da mistura. A sustentabilidade geral da tecnologia proposta neste trabalho foi avaliada pelo impacto ambiental do processo alternativo em termos de avaliação do ciclo de vida (pegada de carbono). Esta tese revela que o uso combinado de fontes de nitrogênio orgânico e inorgânico é recomendado para a suplementação do meio de cultura para o cultivo de R. glutinis e que o uso de LIs e bio-solventes como agentes para o rompimento da parede celular pode ser um procedimento simples, eficiente, sustentável e viável para a recuperação de carotenoides intracelulares da biomassa microbiana.