Identificação de nucleases produzidas por fungos do complexo de espécies paracoccidioides spp.

Abstract

A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica cujos agentes etiológicos são os fungos do complexo de espécies Paracoccidioides spp. As espécies conhecidas até o momento receberam os nomes de Paracoccidioides brasiliensis sensu stricto, Paracoccidioides americana sp. nov., Paracoccidioides restrepiensis sp. nov., Paracoccidioides venezuelensis sp. nov. e Paracoccidioides lutzii. Trata-se de uma doença endêmica da América Latina sendo distribuída de forma heterogênea entre os países como Brasil, Venezuela e Colômbia, sendo considerada uma doença negligenciada devido à falta de notificações, diagnósticos precisos e rápido, entre outros fatores, além também de atingir principalmente populações rurais em condições mais precárias. Recentemente, estudos moleculares evolutivos sugerem que esses fungos possuem diversos mecanismos de patogenicidade e sobrevivência intracelular indicando que dentro do gênero Paracoccidioides pode haver diferenças nos perfis metabólicos de seus representantes, e que essas diferenças desempenham um papel crucial na interação patógeno-hospedeiro. Assim, considerando o mecanismo de escape através da produção de moléculas como a DNAse, que já é descrito por diversos patógenos, e dois padrões diferentes de redes neutrofílicas extracelulares (NETs) encontrados em estudo conduzido com esses fungos, o objetivo deste trabalho foi investigar a presença de possíveis moléculas com ações de nucleases no metabolismo de diferentes cepas de Paracoccidioides spp. (Pb18, Pb265, Pb192, Pb339, Bt85 e P. lutzii). Dentre essas cepas, apenas o Pb18 e o P. lutzii foram capazes de induzir a formação de halo em um meio DNAse Test Agar, indicando que estas são capazes de liberar alguma molécula responsável pela degradação do DNA presente no meio. No ensaio de RT-qPCR, avaliamos a expressão dos genes PADG_11161 (NCBI Reference Sequence NW_011371358.1) e PADG_08285 (NCBI Reference Sequence NW_011371372.1) provenientes do genoma do P. brasiliensis, e PAAG_07101 (NCBI Reference Sequence XM_002790819.1) e PAAG_12429 (NCBI Reference Sequence XM_015847918.1) provenientes do genoma do P. lutzii. Assim, foi possível perceber um aumento da expressão desses genes ao longo dos tempos de incubação, principalmente nos ensaios com Pb18 e P. lutzii. Entretanto, não identificamos a presença direta de alguma proteína como a DNAse no ensaio de proteômica. Dessa forma, utilizamos os bancos de dados disponíveis para evidenciar algumas das proteínas hipotéticas presentes nas amostras analisadas e que poderiam ser interessantes em estudos futuros.

Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis whose etiological agents are the fungi of the species Paracoccidioides brasiliensis sensu stricto, Paracoccidioides Americana sp. nov., Paracoccidioides restrepiensis sp. nov., Paracoccidioides venezuelensis sp. nov. and Paracoccidioides lutzii, all belonging to the Paracoccidioides spp. species complex. It is an endemic disease from Latin American countries with the heterogeneous distribution. The largest number of infected individuals is found in countries such as Brazil, Venezuela, and Colombia. Recently, evolutionary molecular studies suggested different mechanisms of pathogenicity and intracellular survival for the Paracoccidioides spp., demonstrating that this genus presents relevant differences regarding its metabolic profiles, and which should play a critical role during the host-pathogen interaction. Since the production of nuclease molecules like the DNAse II is an important virulence factor already observed in several pathogens, we aimed to search for this kind of protein in different strains of the Paracoccidioides spp. species complex. The strains Pb18 and P. lutzii induced DNA degradation on the DNAse Test Agar plates while the other strains were not able to do so. The RT-qPCR assay indicated that there was an expression of the sequences corresponding to hypothetical proteins with DNAse activity, such as PADG_11161, PADG_08285, and PAAG_07101 genes, mainly in Pb18 and P. lutzii, in different periods. However, the proteomic analyses did not indicate the presence of those proteins induced probably by these genes, and then we searched for the most suspect hypothetical proteins that may have a nuclease activity on a list