Preparação e avaliação de diidroxibenzoatos de alquila contra xanthomonas citri subsp. citri e no controle do cancro cítrico

Abstract

O cancro cítrico afeta variedades citrícolas de importância econômica mundial, sendo causado pela Xanthomonas citri subsp. citri. (Xcc), uma bactéria Gram-negativa. O controle do cancro cítrico é realizado por meio do manejo integrado com aplicações de substâncias cúpricas, plantio de cultivares menos suscetíveis, uso de quebra-ventos e controle da larva minadora de citros. No entanto, o uso excessivo de cobre pode ocasionar acúmulo no solo e afetar negativamente o crescimento radicular de plantas cítricas, e consequentemente a absorção de nutrientes. Por esta razão, a busca por substâncias anti-Xcc seguras ao meio ambiente e eficientes é de crucial importância. Neste trabalho utilizamos o planejamento de substâncias sintéticas anti-Xcc. Sendo assim, foram sintetizados 36 diidroxibenzoatos de alquila (DHB), dentre os quais, 14 apresentaram atividade anti-Xcc. Dentre estes, três ésteres com os menores valores de CIM e com sete carbonos na cadeia lateral (heptila) foram selecionados, 4 (52 μM), 16 (80 μM) e 28 (88 μM). O ensaio de curva de crescimento de Xcc demonstrou que os DHB selecionados promoveram atraso na fase exponencial, prolongando o tempo para Xcc atingir a fase estacionária. O efeito dos DHB 4, 16 e 28 sobre a permeabilidade da membrana de Xcc foi comparado ao controle nisina, sendo o derivado DHB 28 mais efetivo (93,8%), do que 16 (41,3%) e 4 (13,9%). Os dados do ensaio de inibição da atividade GTPásica sugerem que os ésteres 4, 16 e 28 podem promover alterações nos protofilamentos, levando à despolimerização da proteína mutante sensível à temperatura de filamento Z (FtsZ) e assim impedindo a divisão celular bacteriana. A viabilidade de aplicação dos DHB 4, 16 e 28 foi comprovada por meio de ensaios de citotoxicidade, sendo os valores CI50 superiores a 100 μM contra as células eucarióticas testadas. As células de Xcc perderam a capacidade de colonizar o hospedeiro após tratamento com as substâncias 4, 16 e 28 a ½ CIM e CIM, inibindo o aparecimento de sintomas de cancro cítrico nas folhas de laranja doce (Citrus sinensis). Os DHB 4, 16 e 28 foram avaliados quanto a capacidade protetora de plantas jovens de laranja doce e a incidência de sintomas diminuiu 33,3 % (4), 15,3 % (16) e 28,6 % (28), valores próximos ao oxicloreto de cobre (26,7 %). Os ésteres mantiveram comportamento similar ao oxicloreto de cobre em relação a severidade dos sintomas de cancro cítrico. A fitotoxicidade dos três DHB foi avaliada em ensaio com Lactuca sativa, causando menor interferência no crescimento das plântulas quando comparados com o oxicloreto de cobre presente nas formulações a base de cobre utilizadas nas lavouras citrícolas. Os ésteres não causaram alterações nos parâmetros fotossintéticos, tais como a taxa de transpiração, condutância estomática, assimilação máxima, rendimento quântico efetivo de conversão fotoquímica do PSII, coeficiente de extinção fotoquímica do PSII e coeficiente de extinção não fotoquímica do PSII em plantas jovens de C. sinensis. Na avaliação da toxicidade contra abelhas sem ferrão (Scaptotrigona postica), os ésteres 4, 16 e 28 provocaram mortalidade similar ao oxicloreto de cobre.

Citrus cancer affects citrus varieties of worldwide economic importance, being caused by Xanthomonas citri subsp. citri. (Xcc), a Gram-negative bacterium. The control of citrus canker is accomplished through integrated management with applications of cupric substances, planting of less susceptible cultivars, use of windbreaks and control of citrus-mining larva. However, excessive use of copper can cause soil accumulation and negatively affect root growth of citrus plants, and consequently nutrient absorption. For this reason, the search for environmentally safe and efficient anti-Xcc substances is of crucial importance. In this paper we use the planning of anti-Xcc synthetic substances. Thus, 36 alkyl dihydroxybenzoates (DHB) were synthesized, which showed anti-Xcc activity. Among them, three esters with the lowest MIC values and seven carbons in the side chain (heptyl) were selected, 4 (52 μM), 16 (80 μM) and 28 (88 μM). The Xcc growth curve assay showed that the selected DHB promoted exponential phase delay, extending the time for Xcc to reach the stationary phase. The effect of DHB 4, 16 and 28 on Xcc membrane permeability was compared to nisin control, with DHB 28 being the most effective derivative (93.8%) than 16 (41.3%) and 4 (13, 9%). Data from the GTPase inhibition assay suggest that esters 4, 16 and 28 may promote changes in protofilaments, leading to depolymerization of the Filamentous temperature sensitive protein Z (FtsZ) and thus preventing bacterial cell division. The viability of application of DHB 4, 16 and 28 was confirmed by cytotoxicity assays, with IC50 values greater than 100 μM against eukaryotic cells tested. Xcc cells lost the ability to colonize the host after treatment with coumpounds 4, 16 and 28 at ½ MIC and MIC, inhibiting the appearance of symptoms of citrus canker on sweet orange leaves (Citrus sinensis). DHB 4, 16 and 28 were evaluated for the protective capacity of sweet orange young plants and the incidence of symptoms decreased by 33.3% (4), 15.3% (16) and 28.6% (28) to copper oxychloride (26.7%). The esters maintained copper oxychloride-like behavior with respect to the severity of citrus canker symptoms. The phytotoxicity of the three DHB was evaluated in a Lactuca sativa assay, causing less interference in seedling growth when compared to copper oxychloride present in the copper base formulations used in citrus crops. The esters did not cause changes in photosynthetic parameters, such as transpiration rate, stomatal conductance, maximum assimilation, PSII photochemical conversion effective quantum yield, PSII photochemical extinction coefficient and PSII non-photochemical extinction coefficient in young C. sinensis. In the evaluation of toxicity against stingless bees (Scaptotrigona postica), esters 4, 16 and 28 caused similar mortality to copper oxychloride.