Efeito isolado ou combinado de flavonoides e peptídeos catiônicos sobre biofilme endodôntico e sua influência na viabilidade celular, capacidade de migração e inibição de citocinas em fibroblastos

Abstract

Este trabalho foi dividido em dois capítulos que objetivou avaliar: 1) o efeito isolado ou combinado do flavonoide epigallocatechin-3-gallate (EGCG) em associação com o peptídeo LL-37 e seu análogo KR-12-a5 sobre a viabilidade celular de fibroblastos e sobre cultura planctônica, biofilme simples, dual-espécies e túbulos dentináios e 2) as interações sinérgicas do EGCG e proantocianidina do oxicoco (A-type cranberry proanthocyanidins, AC-PAC), quando usado em combinação com LL-37 ou KR-12-a5 sobre a viabilidade celular, a capacidade de migração e inibição das citocinas em cultura de fibroblastos (HGF-1), quando estimuladas ou não pelo lipopolissacarídeo de A. actinomycetencomitans (LPS). No capítulo 1, a concentração inibitória mínima (MIC), a concentração bactericida mínima (MBC) e concentração inibitória fracionária (FIC) de EGCG, LL-37 e KR-12-a5 foram determinadas a partir de valores decrescentes dos compostos por meio dos métodos de microdiluição e checkerboard contra Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Actinomyces israelii e Fusobacterium nucleatum após 24 horas de tratamento. Fibroblastos da linhagem L-929 foram expostos a combinações de EGCG com peptídeos em diferentes concentrações e o metabolismo celular avaliado por ensaios de MTT. Os compostos com melhor efeito antimicrobiano e citotóxico foram avaliados por 24-36h, isoladamente ou em combinação, em biofilmes individuais ou biofilmes de dual-espécies com E. faecalis formados em placas de poliestireno por 48h por meio de contagem bacteriana. Os biofilmes de E. faecalis também foram cultivados em túbulos dentinários por 2 semanas, tratados com EGCG, KR-12-a5 e EGCG + KR-12-a5 e a porcentagem de células mortas foi determinada pela análise de imagens usando Microscopia Confocal. No capítulo 2, a linhagem celular de fibroblastos gengivais humanos primários HGF-1 foi pré-tratada durante 2 h com EGCG ou AC-PAC a 25 e 12,5 µg / mL, LL-37 ou KR-12-a5 a 0,06 e 0,03 µM ou com uma combinação de EGCG + AC-PAC; AC-PAC + KR-12-a5; AC-PAC + LL-37; EGCG + KR-12-a5 ou EGCG + LL-37, nas mesmas concentrações. As culturas celulares foram então estimuladas com 50 µg/mL de LPS por 24-48h. A viabilidade celular e migração foram analisadas usando ensaios colorimétricos e fluorescentes, respectivamente. A quantificação de citocinas foi determinada por ensaios multiplex ELISA. Os resultados mostraram que em condições planctônicas, EGCG + KR-12-a5 apresentaram efeito sinérgico ou aditivo contra todas as bactérias testadas, com FIC menor que os valores de MIC obtidos pelos compostos isolados. As combinações de EGCG e peptídeos testados não foram tóxicas para os fibroblastos, uma vez que o crescimento celular foi superior a 70%. Em condições de biofilme simples, EGCG + KR-12-a5 eliminou S. mutans e A. israelii e reduziu E. faecalis e F. nucleatum. Para biofilmes de duas espécies, quando E. faecalis foi combinado com S. mutans, EGCG + KR-12-a5 teve efeito sinérgico eliminando S. mutans e reduzindo estatisticamente as contagens de E. faecalis. Em biofilmes associando E. faecalis e A. israelii ou F. nucleatum, EGCG + KR-12-a5 eliminaram E. faecalis e promoveram redução de A. israelii e F. nucleatum, embora não tenha sido observada diferença estatística entre os compostos. EGCG + KR-12-a5 reduziu mais de 80% dos biofilmes de E. faecalis nos túbulos dentinários. Dentre os grupos experimentais estudados, o EGCG, principalmente a 25 e 12,5 µg/mL estimulou o crescimento de fibroblastos, protegendo-os dos efeitos do LPS. Efeito sinérgico entre EGCG + AC-PAC, EGCG + LL-37 e EGCG + KR-12-a5 no metabolismo celular também foi observado na presença de LPS. Combinações do EGCG com AC-PAC ou KR-12-a5 e AC-PAC com LL-37 foram capazes de aumentar estatisticamente a migração celular. EGCG, AC-PAC, LL-37 e KR-12-a5 promoveram a redução de citocinas individualmente ou em combinação (EGCG + AC-PAC e EGCG + KR-12-a5) mais especificamente para IL-6, IL-8, GM- CSF e TNF-α. Conclui-se que a associação de EGCG e KR-12-a5 é citocompatível e promove um efeito sinérgico contra bactérias associadas a infecções endodônticas, sob condições planctônicas e de biofilme. O EGCG, isoladamente ou associado ao AC-PAC e ao KR-12-a5, aumenta a viabilidade e migração celular, bem como a inibição de citocinas por fibroblastos estimulados por LPS. A associação de EGCG com KR-12-a5 poderia ser uma opção de princípio ativo em medicações para fins endodônticos.

This study was divided in two chapters that aimed to evaluate: 1) the effect of flavonoid epigallocatechin-3-gallate (EGCG), cationic peptide LL-37 peptide and its analogue KR-12-a5, alone or in combination, on fibroblast cell viability and on bacteria in planktonic and single/dual-species biofilms/dentin tubules; 2) the synergistic interactions of EGCG and cranberry proanthocyanidins (A-type cranberry proanthocyanidins, AC-PAC), when used in combination with LL-37 or KR-12-a5 on cell viability, the ability to induce cell migration and inhibit cytokines in culture of fibroblasts (HGF-1) when stimulated or not by the lipopolysaccharide of A. actinomycetencomitans (LPS). For the chapter 1, Minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and fractional inhibitory concentration (FIC) of EGCG, LL-37 and KR-12-a5 were determined from decreasing values of the compounds by Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Actinomyces israelii and Fusobacterium nucleatum against microdilution and checkerboard after 24 hours of treatment. L-929 fibroblasts were exposed to combinations of EGCG with peptides at different concentrations and cell metabolism assessed by MTT assays. The compounds if the best antimicrobial and cytotoxic effect were also evaluated for 24-36h, alone or in combination, in 48h single- or dual-species biofilms with E. faecalis formed on polystyrene plates by bacterial counting. E. faecalis biofilms were also cultured in dentin tubules for 2 weeks and treated with EGCG, KR-12-a5 and EGCG + KR-12-a5 to determine the percentage of dead cells by analysis of images using Confocal Microscopy. For the chaper 2, primary human gingival fibroblast HGF-1 cell line was pretreated for 2 h with either EGCG or AC-PAC at 25 and 12.5 μg/mL, LL-37 or KR-12-a5 at 0.03 and 0.06 μM or with a combination of EGCG + AC-PAC; AC-PAC + KR-12-a5; AC-PAC + LL-37; EGCG + KR-12-a5 or EGCG + LL-37, at the same concentrations. Cell cultures were then stimulated with 50 μg/mL LPS for 24-48h. Cell viability and migration were analyzed using colorimetric and fluorescent assays, respectively. Quantification of cytokines was determined by multiplex ELISA assays. The results show that in planktonic conditions, EGCG + KR-12-a5 showed a synergistic or additive effect against all the bacteria tested, with FIC lower than the MIC values obtained by the compounds alone. Combinations of EGCG and peptides tested were not toxic to fibroblasts, since cell growth was higher than 70%. Under single biofilm conditions, EGCG + KR-12-a5 eliminated S. mutans and A. israelii and reduced E. faecalis and F. nucleatum. For dual- species biofilms, when E. faecalis was combined with S. mutans, EGCG + KR-12-a5 had a synergistic effect by eliminating S. mutans and statistically reducing E. faecalis counts. In biofilms associated with E. faecalis and A. israelii or F. nucleatum, EGCG + KR-12-a5 eliminated E. faecalis and promoted reduction of A. israelii and F. nucleatum, although no statistical difference was observed between the compounds. EGCG + KR-12-a5 reduced more than 80% of the E. faecalis biofilms in the dentin tubules. Among the experimental groups studied, EGCG, mainly at 25 and 12.5 μg/mL stimulated the growth of fibroblasts, protecting them from the effects of LPS. Synergistic effect between EGCG + AC-PAC, EGCG + LL-37 and EGCG + KR-12-a5 on cell metabolism was also observed in the presence of LPS. Combinations of EGCG with AC-PAC or KR-12-a5 and AC-PAC with LL-37 were able to increase statistically cell migration. EGCG, AC-PAC, LL-37 and KR-12-α5 promoted cytokine reduction individually or in combination (EGCG + AC-PAC and EGCG + KR-12-a5) more specifically for IL-6, IL-8, GM-CSF and TNF-α. The association of EGCG and KR-12-a5 was cytocompatible and promoted a synergistic effect against bacteria associated with endodontic infections under planktonic and biofilm conditions. EGCG, alone or in combination with AC-PAC and KR-12-a5, increases cell viability and migration, as well as inhibition of cytokines by LPS-stimulated fibroblasts. The association of EGCG with KR-12-a5 could be an option as active principle for medications to be used for endodontic purposes.