El género Alphavirus está constituido por virus de ARN de los cuales, varias especies son causantes de enfermedades humanas y animales como los virus chikungunya, Mayaro y los virus de encefalitis equinas, por lo que son considerados un problema de salud pública a nivel regional. En Paraguay han sido reportadas infecciones humanas por chikungunya pero son necesarios más estudios para ampliar conocimientos sobre circulación y ecoepidemiología de los alfavirus. La transcripción reversa de ARN seguida de una reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) anidada es de gran utilidad como herramienta diagnóstica y en la vigilancia epidemiológica. El objetivo de este estudio fue definir las condiciones óptimas de reacción y determinar el límite de detección para una RT-PCR anidada para la detección genérica de alfavirus. El límite de detección obtenido, de 0,47 UFP/mL, indica una alta sensibilidad, pudiéndose aplicar la técnica a muestras humanas y animales de suero, líquido cefalorraquídeo, órganos y a pooles de mosquitos. Este trabajo servirá de base a otros estudios de detección e identificación de especies de alfavirus circulantes en nuestro país, lo que contribuiría a fortalecer su vigilancia y prevención.