Aislamiento, purificación y caracterización de las peptidasas presentes en el fruto de Jacaratia dodecaphylla (VELL. ) (CARICACEAE)

Abstract

Jacaratia dodecaphylla (Vell.) A.DC. es un árbol de la familia de las Caricáceas, de la selva subtropical misionera. El fruto se usa en medicina popular como laxativo suave e indoloro. Los frutos contienen látex y solo son comestibles cuando estan muy maduros. Un extracto con un buffer fosfato de fuerza iónica moderada del mesocarpio del fruto analizado por SDS- PAGE y teñido con Azul Brillante, mostró 11 bandas proteínicas, y una banda no resuelta que migra con el frente. Ocho de estas proteínas estaban glicosiladas. Variaciones en el procedimiento de extracción y en la fuerza iónica del buffer, permitió la separación de dos extractos con un número de bandas diferente, ambos con actividad proteolítica, nominados fracciones A y B, la fracción B contenía tres proteínas de P.M. 29,5kDa, 26,0 kDa , 23,0 kDa y P.\. de las tres sobre 9. Electroforesis en Rocket de la fracción B mostró precipitinas con anticuerpos de quimopapaína y papaína. Infiltración al vacio con agua del tejido durante 5 minutos seguido de centrifigación a baja velocidad para la recuperación del lavado extracelular, permitió la extracción selectiva de cuatro proteínas. Filtración en gel de Sephadex G-75 permitió la purificación de una proteína con un peso molecular analizado por cromatografía de exclusión molecular de 35,2 kDa, por SDS-PADE de 34 kDa y un punto isoelectrico sobre 9. Activadores de las tiol proteasas aumentaron la actividad proteolítica de la enzyma y su actividad fue inhibida por los inhibidores de las mismas, lo que indica que la enzima es una peptidasa cisteínica. La enzima fue muy efectiva para hidrolizar sustratos naturales. Mostró un pico de actividad en condiciones alcalinas y a 65°C. En su estructura no se detectaron carbohidratos. Ensayos de antibiogramas mostraron acción inhibitoria sobre el crecimiento de hifas de Colleotrichum gloeosporioides Y C/adosporium herbaum, caraterizando la enzima como una peptidasa cisteínica extracelular de defensa.