Optimización de la producción y purificación de la enzima Ciclodextrina Glucosiltransferasa de Bacillus circulans DF 9 R para la sintesis de ciclodextrinas: análisis de su escalado y aplicación industrial

Abstract

La Ciclodextrina Glucosiltransferasa (CGTasa) es la única enzima capaz de convertir almidón y sustratos relacionados en ciclodextrinas (CD). Las CGTasas son liberadas al medio extracelular principalmente por cepas del género Bacillus, aunque también por bacterias del género Klebsiella, Micrococcus, Thermoanaerobacteríum, Thermococcus entre otras. Las CD son oligosacáridos cíclicos no reductores formadas por moléculas de glucosa unidas por enlaces a (1-4). Se las denomina a, p y y-CD dependiendo del número de glucosas que poseen (seis, siete u ocho). Las CD tienen una cavidad hidrofóbica y una superficie hidrofílica, por esta causa tienen la habilidad de formar complejos de inclusión con una amplia cantidad de moléculas, cambiando sus propiedades físicas y químicas. Por esta razón tiene aplicación en las industrias alimenticia, farmacéutica, cosmética y agroquímica. En este trabajo se estudió la cinética de crecimiento de Bacillus circulans DF 9R y la producción de CGTasa en relación con los componentes del medio de cultivo y las condiciones operativas del proceso. La formulación y optimización del medio se realizó en frascos agitados utilizando técnicas secuenciales convencionales y diseños estadísticos experimentales. Con este propósito se evaluaron los efectos de los siguientes nutrientes: fuente de carbono, fuente de nitrógeno y sales. Se seleccionó un medio mínimo que contenía como nutrientes almidón de mandioca, sulfato de amonio, Fe2+ y Mg2+ en buffer fosfato de potasio. Las concentraciones óptimas de las fuentes de carbono y nitrógeno se determinaron empleando un diseño centra! compuesto. Las concentraciones fueron 1,5% y 0,4%, respectivamente. Este medio no requirió de una fuente de nitrógeno orgánica ni de composición compleja. Las condiciones óptimas de cultivo para la producción de la enzima fueron: pH inicial 8,1; temperatura de incubación 37°C; agitación 100 rpm y aireación abundante (compatible con una relación medio/ recipiente 1/5 a 1/10). La CGTasa no presentó un perfil de secreción asociado al crecimiento del Bacillus, su producción ocurre en la etapa tardía de la fase de crecimiento celular. Esta enzima es capaz de transformar el 43% del almidón en CD produciendo 14% de a-CD, 25% de |3-CD y 4% de y-CD a los 90 minutos de reacción. Se evaluaron diferentes técnicas de purificación que permitan un fácil escalado. La precipitación fraccionada con sulfato de amonio logró una recuperación de 88,6% y un factor de purificación de 3,9 en la fracción 35-50% de saturación. La adsorción a almidón no solubilizado permitió un 80% de adsorción de la enzima formando el complejo CGTasa-almidón cuando se empleó una concentración de almidón 11,0% y sulfato de amonio 1,6%. La presencia de sulfato de amonio favoreció la adsorción. La enzima fue eluída con una solución 10 mM de a-CD. El factor de purificación fue 17,1 y la recuperación 64,5%. La partición en sistemas de dos fases acuosas se realizó con un esquema en dos pasos. En el primero se empleó un sistema PEG 4000/'fosfato. En el siguiente, la enzima fue extraída de la fase superior del sistema PEG 4000/fosfato con la adición de una solución de sulfato de magnesio y Reppal20o (almidón modificado). Este esquema permitió alcanzar una recuperación final de 72% con un factor de purificación de 36,7. La evaluación financiera determinó que es recomendable invertir (valor actual neio= 25840,46) y que el mismo es rentable (tasa interna de rendimiento= 62%). La inversión inicial se recupera a los 31 meses con un porcentaje de recuperación por año de 37,53%. El análisis económico de! proyecto indicó que el mismo es viable en el entorno local.