Se evaluó la actividad antagónica en aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa causantes de infecciones intrahospitalarias, procedentes de pacientes del servicio de Medicina Interna del Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” , Cumaná-Venezuela. Se identificaron 55 aislamientos de P. aeruginosa mediante métodos convencionales. El antagonismo se determinó por la técnica de la doble capa usando como cepas indicadoras Staphylococcus aureusCVCM636, Bacillus subtilisCVCM591 Escherichia coli K12CVCM178 y P. aeruginosa CVCM787.Los aislamientos produjeron sustancias antibacterianas in vitro, mayormente efectivas contra cepas indicadoras grampositivas, en este sentido, 70,91% (39/55) de los aislamientos logró inhibir a S. aureusCVCM636 y 67,27% (37/55) a B. subtilisCVCM591. Mientras que, P. aeruginosaCVCM787 fue inhibida por 47,27% (26/55) y E. coli K12CVCM178 por 52,72% (29/55). Este estudio permitió demostrar la actividad antagónica en aislamientos clínicos de P. aeruginosa contra cepas bacterianas indicadoras grampositivas y gramnegativas.