Macrophomina phaseolina es un hongo fitopatógeno con un amplio rango de hospederos, el cual causa problemas económicos en muchas especies cultivadas. La caracterización molecular es de mucha importancia al diseñar estrategias de manejo del hongo que involucren la resistencia genética de las plantas. Para esta caracterización es indispensable poseer ADN en suficiente cantidad y calidad. El presente trabajo tuvo como objetivo establecer la forma más eficiente de producir micelio, así como determinar el protocolo más eficaz en la extracción de ADN y en su purificación. Hasta 13,50 mg de micelio se obtuvieron al colocar 10 microesclerocios en 200 μL de caldo papa dextrosa contenido en 1 celda de placas de ELISA incubada a 30°C durante 7 días en oscuridad. La extracción más eficiente se logró usando el buffer de Dellaporta, y repitiendo dos veces el paso de precipitación de proteínas con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1), para posteriormente completar la limpieza con la adición de acetato de amonio 5 M y ARNasa.