Resumen: El objetivo de esta investigación fue caracterizar molecular y morfológicamente 24 aislados de Acanthamoeba, mantenidos en el Laboratorio de Amibiasis -Escuela de Bioanálisis-UCV, mediante PCR-RFLP (Hinffl, Hhal y Haelll), previamente identificados morfológicamente como Acanthamoeba. Ningún aislado perteneció al grupo I. De los 24 aislados, 45,8% presentó características morfológicas compatibles con el grupo II, 45,8% con el grupo III y 8,4% con ambos grupos. Molecularmente, 50% de los aislados amplificaron productos de 900 pb y 50% de 700 pb. Los aislados del grupo III, no se pudieron caracterizar molecularmente por PCR-RFLP, ya que el patrón de digestión no coincidió con patrones publicado. Solo se identificó el 33% de los aislados resultando: A. polyphaga (A9, A12, A13, A14) de A. castellani (A26, A27, A28 y A29) y A. castellani o A. polyphaga (A15, A25, y A30) Las especies identificadas coinciden con los patógenos más comúnmente descritos en la literatura.CDCH