Thesis
Análisis del proceso de traducción in vitro de cepas del virus dengue e inhibición de este mecanismo mediante el uso de oligonucleótidos antisentido
Autor
Camacho García, Daría Elena
Institución
Resumen
El DENV es un flavivirus cuyo genoma es un ARN de aproximadamente 10700
nucleótidos, consituída en sus extremos 5´y 3´terminal por regiones no traducibles (UTR).
La funcionalidad de estos extremos se ha asociado con eventos de supervivencia viral, tales
como la replicación y síntesis de proteínas. Este último mecanismo ha sido escasamente
dilucidado. El objetivo del presente estudio fue analizar el proceso traduccional in vitro de
cepas de los serotipos DENV-1, DENV-2, DENV-3 y DENV-4, y su inhibición con
oligonucleótidos antisentido. Para lograrlo, se obtuvieron los ARN´s de los DENV que
fueron incorporados a un sistema de traducción in vitro obtenido de placenta humana
haciendo uso de la fracción postmitocondrial (S30) como fuente de ribosomas y factores
solubles. Se observaron diferentes porcentajes de estimulación del sistema en relación al
control, específicamente DENV-1 (16007) ~45%, DENV-3 (H87) ~30%, DENV-4 (H-
241) ~60%, mientras que las cepas de DENV-2 -independiente del genotipo viralestimularon
el sistema en ~50%. Verificada la capacidad de estimulación traduccional los
ARNv, se realizaron ensayos de inhibición de este mecanismo haciendo uso de moléculas
antisentido dirigidas contra las estructuras SLA, SLB, CS1 del genoma de DENV-2. Los
resultados mostraron un efecto inhibitorio, exceptuando el dirigido contra la secuencia
ubicada entre los nucleótidos 119 y 141 correspondiente a la cápside viral. Posteriormente,
se analizó el efecto inhibitorio de una molécula dirigida contra una secuencia ubicada entre
los nucleótidos 80 y 99, previo al codón de inicio AUG, incluyéndolo. Los valores de
inhibicion fueron 47, 38 y 100%, para los ARNv de DENV-1, DENV-3 y DENV-4;
respectivamente. Adicionalmente, con el fin de obtener transcritos de DENV-2 se
amplificaron mediante RT-PCR los fragmentos 5´UTR-C para clonarlos en el plásmido
comercial pGEM®-T Easy justo en la secuencia ubicada luego del promotor T7 para
obtener -mediante reacciones de transcripción in vitro con T7 ARN polimerasa- transcritos
de 320 pb. Posteriormente, haciendo uso de los plásmidos recombinantes se amplificaron
productos de 345 pb que abarcaban la región promotora T7 y 5´UTR-C, estos fueron
sometidos a transcripción in vitro en condiciones similares lo que dio lugar a la obtención
de los transcritos. Los resultados demostraron eficiencia traduccional por parte de genomas
de DENV, sugiriendo un proceso canónico para la síntesis de proteínas que pudo ser
inhibido con moléculas antisentido. Asimismo, se obtuvieron transcritos de la región
iniciadora 5´UTR-C susceptibles a ser analizados en ensayos posteriores en el sistema
traduccional mencionado, lo que permitiría comparar estrategias de traducción in vitro. El
bloqueo observado con las moléculas antisentido sugiere su uso para dilucidar aspectos
relacionados con el mecanismo de síntesis de proteínas, así como para el diseño y puesta en
marcha de estrategias antivirales contra DENV y cualquier otro virus de tipo ARN.