La leishmaniasis es una de las seis enfermedades tropicales más importantes mundialmente, con pleomorfismo clínico y epidemiológico relacionado con las especies. La identificación de especies de Leishmania orienta al tratamiento y la sensibilidad del parásito a medicamentos. La amplificación de fragmentos por la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) seguido del análisis del Polimorfismo de la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP) permite la identificación y la caracterización de especies de este género. El objetivo del estudio fue diagnosticar especies de Leishmania y su variabilidad genética, en biopsias de pacientes con leishmaniasis cutánea localizada, implementando la técnica molecular PCR-RFLP. Se realizó estudio prospectivo, descriptivo y experimental; en pacientes de la consulta de Leishmaniasis del Instituto de Biomedicina, mayo a noviembre 2009. Incluidos 53 pacientes, se solicitó la firma del consentimiento informado y autorización para fotografías clínicas. Leishmanina, frotis por escarificado, biopsia de piel, cultivo, PCR y PCRRFLP fueron realizados a todos los pacientes. Obtuvimos que 38/53 (72%) fueron positivos para Leishmania spp, 29/53 (76%) positivos para Leishmania (V.) braziliensis y 9/53 (24%) para Leishmania (L.) mexicana. Demostramos variabilidad genética en 21% en Leishmania (V.) braziliensis. No se estableció relación entre manifestaciones clínicas y respuesta terapéutica con variabilidad genética entre especies. Deben realizarse estudios con mayor número de muestras. Concluimos que la combinación de técnicas moleculares no solo es útil para el diagnóstico de la enfermedad, sino que permite la identificación de las especies que producen la enfermedad, así como las variaciones genéticas dentro de la misma especie.