Desarrollo de un "pipeline" de trabajo para secuenciación dirigida por crispr-cas9

Abstract

El presente trabajo final de carrera se enfoca en una de las más recientes tecnologías de secuenciación de tercera generación, MinION de Oxford Nanopore, el dispositivo de secuenciación más pequeño disponible. El objetivo fue desarrollar un “pipeline” de trabajo para la secuenciación dirigida de fragmentos de más de 10 kb en la plataforma MinION. Para analizar los fragmentos, se realizó la secuenciación por MinION de Oxford Nanopore mediante una técnica basada en CRISPR-Cas9. Dicha técnica utiliza la capacidad de la Cas9 (endonucleasa Cas9) para introducir cortes en ubicaciones específicas y poder luego ligar adaptadores de secuenciación directamente a esos sitios (nCATS). Esta técnica no necesita un proceso de amplificación por lo que se obtiene información directamente de la molécula nativa de ADN. El desarrollo del "pipeline" incluyó ajustes a los protocolos de extracción de ADN para evitar fragmentación, desarrollo y puesta a punto de un método de evaluación de la eficiencia de corte del sistema CRISPR-Cas9 en la región de interés mediante PCR en tiempo real y secuenciación con dos tipos de celdas de la región del gen MC1R. Además, se realizó un análisis económico de la secuenciación dirigida por nCATS. Se detectaron algunos problemas posibles que podrían explicar esta baja cobertura. Son necesarias más pruebas de secuenciación con mejores condiciones de las celdas para evaluar de manera adecuada la eficiencia del “pipeline” desarrollado. El potencial de esta técnica, junto con la baja inversión del minION podría ser un gran avance en la investigación y la medicina translacional, ya que permitiría estudiar variantes génicas, estructurales, haplotipos y metilación de grandes regiones genómicas de los individuos a un bajo costo.