Diseño y construcción de vectores para suprimir la expresión de los genes Lrrc8d, Slc4a3, Slc4a4 mediante la técnica shRNA

Abstract

La calidad de vida para muchos se ve afectada por una hipofunción de las glándulas salivales, al ser grave esta afección no cuenta con tratamientos que permitan revertirla. La saliva, está controlada por el SNA y los centros cerebrales. La secreción parasimpática se asocia con un gran volumen de líquido y baja concentración de proteínas; mientras que, la secreción simpática es de menor volumen y una mayor concentración de proteína, esta última requiere de una ruta apical de eflujo de Cl-. Tres canales de Cl- se han descrito en las células acinares de la glándula salival del ratón: CaCC codificado por el gen Tmem16A, un canal activado por hiperpolarización codificado por el gen ClC-2, y un canal de aniones activado por un aumento en el volumen (VRAC). Estudios pasados ya demostraron que la estimulación de los receptores beta-adrenérgicos activa una vía de secreción de saliva que no depende de canales Tmem16A o ClC-2. Entonces se hipotetizó que el eflujo de Cl- requerido en la secreción dependiente de cAMP ocurre a través de VRAC. La expresión de genes como Slc4a3 (Ae3) y Slc4a4 (NBCe1) que codifican para transportadores de HCO3-, también han sido postuladas como candidatos. La técnica de silenciamiento genético por medio de shRNA (small hairpin RNA), es una técnica realizada en el núcleo que sirve para inhibir la actividad de un gen específico. El propósito de esta tesis fue diseñar y construir vectores que permitan suprimir la expresión de los genes Lrrc8d, Slc4a3 y Slc4a4 en glándulas salivales de ratón, los cuales se postulan como proteínas transportadoras de iones que juegan un rol importante en la secreción salival dependiente de AMPc. Es así que se diseñaron shRNA que tengan complementariedad de secuencia con el mRNA de Lrrc8d, AE3 (Slc4a3), Nbce1 (Slc4a4), posteriormente se clonaron los shRNA en el vector pMKO.1 puro/pMKO.1-GFP y su adecuada inserción fue verificada mediante técnica de secuenciación, finalmente para confirmar la supresión en la expresión de los genes, se realizó RT-PCR en línea celular C2C12 de ratón, obteniendo el bloqueo de la expresión de los genes Lrrc8d y Slc4a3, a diferencia del Slc4a4 que no pudo llegar a ser transfectado