Estandarización de una PCR y qPCR para detectar y cuantificar Fowl Adenovirus Tipo 4 (FAdV-4) en FARVET S.A.C, 2017-2018

Abstract

Las enfermedades producidas por adenovirus aviar tipo 4 (FAdV-4) se trasmiten en forma vertical y horizontal causando grandes pérdidas económicas en el sector avícola, es por ello que existe la necesidad de llevar a cabo un proceso de estandarización de una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar y cuantificar nuestro virus de interés. Para ello en la presente investigación se procedió a realizarlo en tres (03) fases: La primera consistió en la preparación del material de referencia interna en donde se extrajo el ADN, a partir de un cultivo células EB66, midiendo su cantidad del amplicón a través del Fluorómetro Qubit 2.0. La segunda fase fue estandarizar la PCR convencional, en esta fase se procedió a la selección de los cebadores (Primer´s) específicos, éstos fueron HHS*-2, HHS*-3 y HHS*-4; se realizó la prueba de su gradiente de temperatura basándose en el kit de PCR Q5® High-Fidelity 2X Master, seguido se realizó la prueba de concentración de cebadores, la prueba de sensibilidad siendo el 100% para los tres sets de cebadores y la prueba de especificidad obteniendo como resultado el 46.15%, 100% y 91.67% respectivamente. La tercera fase consistió en estandarizar PCR en tiempo real, en esta fase se usó el sets de cebadores HHS*-3 (0.25 umol/L) con 107 copias virales, se realizó diluciones sucesivas con diferentes concentraciones de copias virales desde el estándar HHS7 hasta HHS0, haciendo uso del equipo de LightCycler ® 480 SYBER Green I Master y el equipo Rotor Gene 6000 Real-Time PCR, los cuales nos dieron una exactitud y un Coeficiente de correlación de Pearson (R2) mayor al 99%, detectando hasta una concentración de amplicón ≥1pg/ul.