Evaluación del efecto del AZT y de nuevos inhibidores de la unión DKC1-hTR sobre las actividades del complejo telomerico en modelos tumorales

Abstract

La inmortalidad celular es uno de las principales características del cáncer. Las células tumorales tienen un potencial replicativo ilimitado debido, en la mayoría de los casos, a la actividad de la telomerasa. Esta holoenzima mantiene la longitud de los telómeros a partir del agregado de repeticiones TTAGGG al extremo cromosómico. Dado que esta enzima se encuentra presente en más del 80% de los tumores sólidos, la misma se ha convertido en un blanco interesante para el desarrollo de terapias dirigidas contra el cáncer. El cáncer de mama es una de las patologías oncológicas más comunes, con más de 1.300.000 casos y 450.000 muertes anuales a nivel mundial. El tratamiento para el cáncer mamario incluye cirugía, radioterapia y terapia sistémica. Si bien se desarrollaron en las últimas décadas estrategias terapéuticas muy eficaces para el cáncer mamario, aquellos tumores que se clasifican como triple negativos siguen siendo difíciles de tratar ya que se trata de una enfermedad biológicamente agresiva con pocas opciones terapéuticas. Por otra parte, más del 90% de los tumores mamarios presentan actividad de la holoenzima telomerasa, siendo este porcentaje aún mayor en tumores de mayor agresividad y casi nulo en tejidos adyacentes o tumores benignos. Este escenario propicia el estudio de esta enzima como un potencial blanco para el desarrollo de nuevas drogas para el tratamiento del cáncer mamario triple negativo. La presente tesis presenta dos ejes principales: a) analizar cómo la Azidotimidina (AZT), la cual presenta una comprobada eficacia en la inhibición de la telomerasa, ejerce su acción sobre las actividades extrateloméricas de TERT; b) el desarrollo y evaluación de nuevos inhibidores de la telomerasa a partir de la interrupción de la unión hTR-disquerina (DKC1) en el ensamblado de la holoenzima. El primer capítulo se enfoca en las actividades extrateloméricas que presenta la telomerasa en el desarrollo tumoral. En este área, se ha determinado que TERT, principal componente de la telomerasa, actúa como modulador transcripcional en diversas vías de señalización. Durante muchos años se consideró que el AZT solo ejercía su acción antitumoral como terminador de cadena. Sin embargo, no existen evidencias contundentes acerca de su efecto sobre las actividades extrateloméricas de TERT. En función de lo antes mencionado, y dada la experiencia del grupo en el estudio del AZT como inhibidor de la actividad telomerasa, se analizó su efecto sobra las funciones no canónicas de TERT. Para esto se evaluaron genes modulados por la vía Wnt-βCatenina y NF-κB, y procesos tales como migración, adhesión y ciclo celular en células de carcinoma mamario murino F3II. Los resultados obtenidos luego de 15 pasajes con AZT (600 µm) corroboran el efecto sobre la actividad telomerasa. En torno a las actividades extrateloméricas o no canónicas, se determinó un descenso del 64% (p<0.05) en la transcripción de c-myc; un efecto similar sobre la transcripción de cyc-d1 (38% p<0.05); una caída del 80% en la expresión de tnf-α y en menor medida una baja sobre la expresión de tert e il6 (25% p<0,05 y 30% p<0,05, respectivamente). Paralelamente se evaluó el efecto sobre la migración, alcanzando una inhibición del 48% (p<0.05). Además, se determinó el tiempo de duplicación de las células a distintos pasajes del tratamiento, obteniéndose un aumento de más de 3 veces en las células tratadas durante 15 pasajes en comparación con el control (p<0,001). Por último, se estudió el efecto sobre ciclo celular, donde se pudieron observar cambios sutiles en las poblaciones de las distintas fases del ciclo celular en las células tratadas con AZT. Estos resultados nos permiten postular a dicha molécula no sólo como un inhibidor de la actividad telomerasa, sino también, como un posible modulador de los procesos extrateloméricos en los cuales se encuentra involucrada. La segunda parte aborda la búsqueda y validación de nuevos inhibidores contra la holoenzima telomerasa. Para ello se ideó una estrategia dirigida a desestabilizar el complejo telomerasa a partir de la interrupción de la unión hTR-DKC1. Para llevar a cabo este trabajo se modeló la estructura tridimensional de DKC1 humana. Esta estructura se utilizó para realizar un ensayo de screening virtual basado en docking sobre el dominio PUA de esta proteína a partir de una biblioteca de 300.000 compuestos de tipo “drug like”. A partir de este ensayo se seleccionaron los primeros 20 compuestos que mostraron mayores valores de afinidad para proceder a la evaluación in vitro en la línea de adenocarcinoma mamario MDA MB 231. Luego de 48 h de tratamiento con los compuestos denominados 10 y 15 a una dosis 2M, se encontró una disminución de la actividad telomerasa del 57,3% y 54,6% (p<0,001), respectivamente. A partir de esta información, se continuó el tratamiento con estos compuestos durante 55 pasajes, resultando en un acortamiento telomérico del 66% y 47% para los compuestos 10 y 15 respectivamente (p<0,001). Luego se procedió a evaluar el efecto del tratamiento sobre la senescencia celular, obteniéndose para el compuesto 10 un incremento de 4 veces en la expresión de p16ink4a (p<0,001) y tinción positiva para la actividad SA β-galactosidasa, no encontrándose diferencias significativas con el compuesto 15. Respecto a los marcadores de apoptosis, para el compuesto 10 se obtuvo un aumento de 2,3 veces en la relación bax/bcl2 (p<0,001) y un incremento del 55% en la actividad caspasa 3 respecto a las células control (p<0,01). Estos resultados nos permiten postular al compuesto 10 como un inhibidor novedoso de la actividad telomerasa, validando la estrategia utilizada durante este trabajo para el desarrollo de una terapia dirigida. En conclusión, el presente trabajo ha permitido establecer las bases para el estudio del AZT como modulador de las actividades extra teloméricas de TERT involucradas en el desarrollo tumoral, más allá de su efecto como inhibidor de la actividad telomerasa. Por otra parte, hemos obtenido un compuesto novedoso con capacidad inhibitoria de la actividad telomerasa, el cual presentó sus efectos sobre una línea celular de cáncer de mama tipo triple negativo. Teniendo en cuenta la información existente y los resultados obtenidos, disponemos de una molécula novedosa con características aptas para su utilización, como terapia blanco específica, en el tratamiento de cáncer de mama triple negativo, con potencial aplicación clínica.