Producción de manitol por bacterias lácticas

Abstract

El manitol es un poliol con múltiples aplicaciones industriales siendo utilizado principalmente como edulcorante de bajas calorías en la industria alimenticia siendo aplicable en alimentos dietéticos y aptos para diabéticos. La producción industrial de manitol se lleva a cabo por reducción catalítica de mezclas de glucosa/fructosa a altas temperaturas y presiones. Este proceso es costoso y poco eficiente obteniéndose manitol junto con sorbitol en la mezcla final. Estas limitaciones alentaron el estudio de la producción biotecnológica de manitol mediante fermentaciones. Algunas BL heterofermentativas como Lactobacillus reuteri pueden utilizar fructosa como aceptor alternativo de electrones y producir manitol por acción de la enzima manitol 2-deshidrogenasa (MDH). En esta Tesis doctoral se utilizó la cepa L. reuteri CRL 1101 para la optimización de la producción de manitol. Se evaluó: tipo y concentración de la fuente de carbono (fructosa, glucosa/fructosa y melaza de caña de azúcar; 3,0-10,0%, p/v), temperatura (30 y 37 °C) y tiempo de fermentación (hasta 72 h), efecto de la agitación de los cultivos (100 rpm), y fase de crecimiento del microorganismo (lag, logarítmica y estacionaria). La melaza de caña de azúcar ―subproducto de la industria azucarera local― resultó un sustrato adecuado para la producción de manitol por L. reuteri CRL 1101. Se formuló un medio de cultivo minimizado (MLC)conteniendo melaza, extracto de levadura y extracto de carne evaluándose posteriormente el efecto de la biomasa inicial y del pH del cultivo en este medio. Esta cepa produjo 228 ± 6 mM (42 ± 1 g/L) de manitol en condiciones de cultivo optimizadas: medio MLC, agitación (100 rpm), inóculo= 0,001 g/L, pH 5,0, 37 °C y 24 h de incubación. Esta es la máxima producción de manitol informada a la fecha usando una cepa salvaje de L. reuteri. También, se realizaron estudios moleculares sobre la producción de manitol usando un medio químicamente definido bajo condiciones de producción de manitol (presencia de fructosa) vs no producción (ausencia de fructosa). Se evaluó actividad MDH, la expresión del gen mdh ―que codifica para esa enzima― mediante qPCR y la expresión diferencial de proteínas intracelulares mediante estudios proteómicos. La enzima MDH mostró niveles basales de actividad (~0,5 U/mg prot) en ausencia de fructosa. Esta actividad fue fuertemente inducida por fructosa a las 8 h de incubación, observándose un incremento de 6 veces (3,0 ± 0,2 U/mg prot) respecto al control. El gen mdh se expresa de manera constitutiva en ausencia de fructosa aunque la presencia de este azúcar regula positivamente su expresión aumentando 42 veces en fase logarítmica. La correlación entre la expresión del gen mdh y la actividad MDH encontrada sugiere que la regulación de la expresión génica ocurre a nivel transcripcional. Durante la fase logarítmica, en ambas condiciones se expresan enzimas que participan en el metabolismo de azúcares, transcripción, traducción y metabolismo de nucleótidos. En condiciones de producción de manitol se sobre-expresan proteínas que participan del catabolismo de azúcares por la vía EMP, demostrando que L. reuteri CRL 1101 posee los genes para metabolizar azúcares por ambas vías.