doctoralThesis
Identificación y desarrollo de nuevas moléculas inhibitorias de mecanismos de patogénesis bacteriana
Autor
Carabajal, María Ayelén
Institución
Resumen
El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ regula numerosos fenotipos de
virulencia en Salmonella enterica. La proteína sensora PhoQ alterna su estado de
autofosforilación en respuesta a la disponibilidad de Mg2+, CAMPs, LCUFAs y
variaciones de pH y osmolaridad en el medio, lo cual define el nivel de fosforilación del
regulador de respuesta PhoP que activa la expresión de genes necesarios para la virulencia
de Salmonella. Este sistema constituye un blanco estratégico para la búsqueda y
desarrollo de compuestos que modulen específicamente su acción, destinados a la
identificación y diseño racional de nuevos compuestos con potencial farmacológico que
prevengan la capacidad infectiva de esta bacteria patógena.
Como parte del trabajo de tesis del Dr. Gastón Viarengo, se estableció que el
blanco de acción de los LCUFAs en el mecanismo de transducción de señales del sistema
PhoP/PhoQ es la actividad autoquinasa de la proteína sensora PhoQ. En este sentido,
durante el presente trabajo de tesis evaluamos el accionar de los LCUFAs a nivel
molecular sobre la HQ PhoQ. Esta proteína presenta dos regiones transmembranas
resultando en un dominio citoplásmico (PhoQc) y un dominio sensor periplásmico
(PhoQp), siendo este último el posible encargado del reconocimiento de la señal.
Trabajando con PhoQp soluble y purificado, se realizaron ensayos biofísicos para estudiar
la interacción de los LCUFAs con la HQ PhoQ.
Mediante ensayos de TS en presencia de concentraciones crecientes de ácido
linoleico en configuración cis (c,c-18:2) y de ácido esteárico (18:0), identificamos una
disminución de la Tm de PhoQp dosis-dependiente al aumento de la concentración de
c,c-18:2 adicionado respecto a la proteína sin agregado o con 18:0. Este efecto en la Tm
también lo presenciamos al examinar la estereoespecificidad en el accionar de los
LCUFAs sobre PhoQp, trabajando con el ácido linoleico en configuración trans (t,t-18:2),
y el ácido linoleico conjugado (CLA). Así, establecimos un efecto desestabilizante de
PhoQp ante la presencia de los diferentes ácidos grasos insaturados, que no es
esteroespecífico y que no se observó en presencia del ácido graso saturado de igual
longitud.
La asignación del espectro 1H-15N-HSQC-RMN de PhoQp en las condiciones
previamente trabajadas, permitió identificar los aminoácidos afectados por la presencia
de c,c-18:2 y CLA. De esta manera, identificamos que la región de la lámina β2 y β3 y su
loop conector de PhoQp se vieron alterados ante la presencia de c,c-18:2 y CLA. En los ensayos de TS y 1H-15N-HSQC-RMN se trabajó paralelamente con MgCl2
en el medio como control, ya que el catión Mg2+ extracelular actúa como ligando de la
proteína PhoQ interaccionando específicamente con PhoQp. En primer lugar, los ensayos
de TS evidenciaron un efecto del MgCl2 sobre PhoQp contrario al observado con los
LCUFAs, identificado como un aumento de la Tm de la proteína ante concentraciones
crecientes del ligando. En segundo lugar, la técnica de 1H-15N-HSQC-RMN de PhoQp
con c,c-18:2 y en presencia y ausencia de MgCl2 20 mM determinó que el efecto
estabilizante que ejerce el catión divalente sería dominante y diferente frente al accionar
de los LCUFAs sobre PhoQp. Esto se reflejó en la superposición del espectro de PhoQp
con MgCl2 y c,c-18:2 que mostró un patrón similar al espectro de PhoQp en presencia de
solamente MgCl2. Así, establecimos que los LCUFAs modifican conformacionalmente a
la HQ de manera reversible y tendrían un sitio de acción sobre PhoQp diferente a lo
previamente establecido para el catión Mg2+.
Con el fin de identificar el sito de acción específico de PhoQ que interaccionan
con los LCUFAs se buscó obtener la estructura cristalográfica de PhoQp y c,c-18:2.
Mediante técnica de cristalogénesis por medio de un cribado robótico, identificamos las
condiciones iniciales para obtener cristales de PhoQp en presencia de c,c-18:2. La
optimización de estas condiciones en mayor volumen permitió obtener cristales de
tamaño suficientes para ser empleados en experimentos de difracción de rayos X. Sin
embargo, esta alcanzó baja resolución y resultó anisotrópica por lo cual no fue posible
avanzar en intentos de resolver la estructura cristalográfica de PhoQp unido c,c-18:2.
En conclusión, los resultados obtenidos en esta primera etapa de trabajo de tesis
establecieron el accionar de los LCUFAs como nuevos moduladores del sistema
PhoP/PhoQ. Los LCUFAs actúan como ligandos de la proteína sensora PhoQ, los cuales
pueden ser detectados en el curso del ciclo infectivo de Salmonella en el contenido
gastrointestinal, y así modular la virulencia de la bacteria.
Como segunda parte de este trabajo de tesis, se llevó a cabo una nueva estrategia
para identificar nuevos compuestos con potencial farmacológico que prevengan,
controlen y/o bloqueen la capacidad infectiva de S. Typhimurium. Para ellos, trabajamos
con una biblioteca de 687 compuestos provistos por la compañía GSK, PKIS1 y PKIS2,
diseñada con el fin de incluir nuevos perfiles de inhibición del quinoma eucariota.
Como primera etapa en la estrategia de identificación, se llevaron a cabo medidas
de actividad β-galactosidasa utilizando dos cepas reporteras con genes representativos perteneciente al regulón PhoP de S. Typhimurium (virK y pagC) y una cepa reportera con
un gen regulado por otro TCS (tppB). Con los resultados obtenidos, y descartando
aquellos compuestos que alteraron el crecimiento de las cepas reporteras utilizadas,
seleccionamos los compuestos que solo afectaron la actividad de los genes regulados por
el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ en un porcentaje mayor al 50%. De esta
manera, identificamos dos compuestos con estas características, denominados
GI261520A y GI262866A, que a su vez presentan una estructura similar.
Continuando con la caracterización, realizamos una segunda etapa de selección
mediante ensayos de actividad β-galactosidasa utilizando nuevas cepas reporteras de S.
Typhimurium de genes pertenecientes al regulón PhoP/PhoQ (pagK, pcgM, pcgF y pipD)
e incluimos compuestos con estructura análoga a los dos compuestos identificados. Así,
validamos los resultados previos de GI261520A y GI262866A como moduladores del
sistema PhoP/PhoQ. Además, establecimos la importancia de los sustituyentes metoxilo
(GI261520A) o alcohol (GI262866A) en la posición número 6 en el anillo de quinazolina
y del segundo anillo de bencilo para la actividad inhibitoria.
Una vez identificadas las moléculas de interés, buscamos establecer el blanco de
acción de los compuestos GI261520A y GI262866A sobre el sistema PhoP/PhoQ.
Mediante diferentes ensayos de actividad autoquinasa, establecimos que ambas moléculas
actúan como inhibidores competitivos del sitio de unión al ATP de la proteína de
membrana PhoQ. Estos resultados fueron reforzados mediante una técnica bioinformática
de acoplamiento molecular en donde se predijeron interacciones claves que se producen
entre GI261520A o GI262866A con el sitio de unión al ATP del dominio citoplásmico
de PhoQ.
Por último, establecimos la capacidad de GI262866A y GI261520A para bloquear
la supervivencia y la replicación de S. Typhimurium en el interior de células de
macrófagos, mediante un experimento de infección convencional basado en el ensayo de
protección a la gentamicina. Estos resultados nos permitieron postular a GI262866A y
GI261520A como un agente de anti-virulencia, con potencial para combatir la infección
por Salmonella.
Como conclusión, en este trabajo de tesis pudimos caracterizar diferentes
compuestos con actividad inhibitoria sobre el sistema de dos componentes de PhoP/PhoQ
que ordenamos en dos grupos. En el primero están los LCUFAs, que tienen como blanco de acción el dominio sensor de PhoQ, y en el segundo están GI262866A y GI261520A,
que interaccionan específicamente con el sitio de unión al ATP de PhoQ. Fil: Carabajal, María Ayelén. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina.