Relevancia fisiológica de los receptores de lipoforina y vitelogenina en la regulación de la ovogénesis en los vectores de la enfermedad de chagas

Abstract

Los triatominos son insectos hematófagos obligados con relevancia en salud pública por ser los vectores de la enfermedad de Chagas. Las hembras de estas especies requieren de la ingesta de sangre a los fines de lograr una exitosa ovogénesis, proceso controlado principalmente por la Hormona juvenil (HJ). En este trabajo de Tesis se empleó como modelo a Dipetalogaster maxima en diseños experimentales que combinaron ensayos funcionales clásicos con estrategias bioquímicas y moleculares tendientes a lograr una mejor comprensión del rol de HJ en la regulación de la vitelogénesis y la ovogénesis. En este contexto, los objetivos se focalizaron en el estudio de los procesos de reclutamiento de lípidos y proteínas por los ovocitos en desarrollo y en la participación de Met, el receptor de HJ, en la fisiología del tejido ovárico. Los resultados demostraron que en D. maxima los niveles de HJ III skip-bis epóxido (HJSB3), la forma molecular de HJ presente en la hemolinfa de D. maxima, aumentó significativamente luego de la ingesta de sangre. De modo similar, también aumentaron los transcriptos de las proteínas precursoras del vitelo (PPV), vitelogenina (Vg) y lipoforina (Lp), en cuerpo graso y sus niveles proteicos en circulación. Concomitantemente, los genes de los receptores endocíticos de las PPV, RVg y RLp se encontraron regulados positivamente en el ovario. Cuando las hembras pre-vitelogénicas con bajos niveles de HJSB3 fueron tratadas con HJ exógena se indujo la expresión de los genes Lp/RLp y Vg/RVg, así como la captación de Lp y Vg por los ovocitos. En tanto, la aplicación de precocene II o el silenciamiento del gen RLp mediante ensayos de ARNi en hembras alimentadas interfirieron, en distinta magnitud, con el depósito de las PPV en los ovocitos pero no con el reclutamiento de lípidos, demostrando que la adquisición de estas reservas se realiza privilegiando la transferencia de lípidos vía Lp a nivel de membrana por sobre la vía Lp/RLp. Los resultados de esta tesis fueron consistentes con el papel de Vg como un gen “respondedor” a HJ y sugieren fuertemente que la señalización de HJ estaría involucrada en el almacenamiento de lípidos en los ovocitos al regular el gen Lp en el cuerpo graso y modular la expresión de los genes RLp y RVg en el tejido ovárico. En este trabajo también se analizó la participación de Met en la fisiología del tejido ovárico, reportándose por primera vez en un vector de la enfermedad de Chagas los cambios del transcripto Met en el cuerpo graso y tejido ovárico en días representativos del ciclo reproductivo de D. maxima. Los resultados mostraron que en ambos tejidos, los niveles de ARNm para Met aumentaron con el inicio de la vitelogénesis siendo máximos al día 4 post-alimentación. Posteriormente se registró la disminución significativa del transcripto Met en días avanzados de la fase vitelogénica y en la post-vitelogénesis, los que mostraron niveles comparables a los registrados en la pre-vitelogénesis. El gen Met de D. maxima (DmaxMet) fue secuenciado, posibilitando la caracterización genómica mediante análisis bio-informáticos, la inferencia sobre su historia evolutiva y la realización del modelado para evaluar, in sílico, la interacción entre Met y HJ. En este sentido, el modelado mostró por un lado, el mapeo de cargas electrostáticas, revelando dos parches con concentraciones de cargas opuestas; mientras que la inspección de la hidrofobcidad no reveló ninguna distribución distintiva. Finalmente, los ensayos de interacción in silico (“docking”) entre DmaxMet y sus variantes moleculares HJ III y HJSB3 mostraron alta afinidad por el dominio PAS B. También se infirió que es mayor la afinidad de DmaxMet por HJSB3, la forma molecular de HJ presente en la hemolinfa de D. maxima. Desde el punto de vista fisiológico y funcional, el silenciamiento de Met indujo una disminución significativa en los niveles del transcripto Vg2. Este resultado, esperable para un gen que responde a HJ, permitió inferir que en D. maxima, la principal PPV es inducida según la vía clásica HJ-Met descripta en el cuerpo graso de otras especies de insectos. El silenciamiento de Met también indujo una “down” regulación de RVg y RLp y un menor desarrollo del tejido ovárico, sugiriendo que Met también sería un actor crítico para modular, vía HJ, el desarrollo de este tejido. Analizados en conjunto, los avances reportados en esta tesis permitirán analizar en D. maxima los eventos cascada abajo implicados en la acción regulatoria de HJ-Met sobre las PPV y sus receptores endocíticos en el desarrollo ovárico. En el contexto de la fisiología de los vectores de la enfermedad de Chagas, estos aspectos son de singular relevancia para el ciclo de vida de las hembras y consecuentemente, para la epidemiología de la enfermedad.