Análise imunohistológica da Endostatina, MMP-2 e MMP-9 em rins de camundongos submetidos à isquemia e reperfusão

Abstract

A injuria renal aguda (IRA) e uma sindrome, resultante da queda abrupta na filtracao glomerular. A isquemia e a principal causa da IRA e, invariavelmente, promove a restricao de oxigenio e nutrientes e o acumulo de metabolitos nos tecidos. O processo de reperfusao tecidual, fundamental para recuperacao renal, e tambem, uma agressao adicional principalmente pelo aumento na producao de radicais livres durante a re-oxigenacao. Alteracoes vasculares ocorrem desde a fase de iniciacao da IRA e estendem-se para o processo de reperfusao apesar disto, o seu papel na fisiopatologia ainda e muito desconhecido. O colageno XVIII esta presente na membrana basal endotelial e epitelial renal. A regiao NC1 deste colageno pode sofrer clivagem e liberar endostatina (ES) e suas isoformas. As metaloproteinases de matriz (MMPs) sao uma familia de enzimas zincodependentes, intimamente relacionadas, que degradam a matriz extracelular. A MMP-2 e a MMP-9 sao gelatinases que clivam a maioria das macromoleculas da matriz extracelular, incluindo o colageno XVIII. Camundongos machos, C57BL/6 foram submetidos a 45 minutos de isquemia e os tempos de reperfusao estudados foram: 4,12, 24, 48, e 72 horas. Realizou-se a coleta de sangue e rins em todos os tempos. A funcao renal foi avaliada pela dosagem de ureia, analise histologica e imunohistoquimica (PCNA). A semi-quantificacao da ES foi realizada por western blotting. Atividade gelatinolitica foi realizada por zimografia com gelatina. A localizacao e colocalizacao da ES, MMP-2 e MMP-9 foram realizadas por imunohistoquimica e imunofluorescencia. Os animais entraram em insufiCiência aguda na isquemia (p<0,05), ate 48 horas de reperfusao. O maior comprometimento da funcao renal ocorreu em 24 horas de reperfusao (p< 0,001). A funcao renal normalizou 72 horas apos a reperfusao. As celulas dos tubulos medulares apresentaram maior indice de proliferacao. Os niveis de ES aumentaram com a isquemia, cairam no inicio da reperfusao e voltaram a subir de maneira tempo-dependente ate 72 horas. A atividade gelatinolitica da MMP-2 nao sofreu alteracao significativa neste modelo, a MMP-9 apresentou atividade aumentada em todos os tempos. A imunohistoquimica mostra ES na membrana basal glomerular, celula endotelial e vasos peritubulares. A MMP-2 e expressa nas celulas glomerulares e fibroblastos peritubulares. A imunomarcacao da MMP-9 foi citoplasmatica (difusa) e nuclear, em tubulos e glomerulos. A colocalizacao da ES e MMP-2 foi visualizada no citoplasma das celulas tubulares no rim normal, isquemico, 4,12 e 48 horas, em 12 horas de reperfusao houve colocalizacao nuclear no glomerulo. MMP-9 e ES co-localizam no rim normal, 48 e 72 horas tanto citoplasmatica quanto nuclearmente, enquanto que nos outros periodos ha co-marcacao nos nucleos tubulares, em 45 minutos de isquemia, 4 e 12 horas nas celulas glomerulares. Nos tubulos corticais a ES diminui, a MMP-2 aumenta (30%) e normaliza em 72 horas para menos de 1% dos tubulos, a MMP-9 tambem diminui e so normaliza em 72 horas (40%). Nos glomerulos, ha predominancia da MMP-2, a ES e pouco presente atingindo pico em 4 horas para 40%; a MMP-2 aumenta ate 4 horas (90%), e diminui para 30% em 72 horas; a MMP-9 apresenta aumento de mais de 30% (normal) para 50% em 24 horas, reduzindo para menos de 1 % em 72 horas. Nos tubulos medulares a ES esta em 70% no normal diminuindo nos outro periodos, a MMP-2 aumenta do rim normal ate 12 horas (30%), reduz em 24 horas (20%), aumenta em 48 hs (30%) e e praticamente ausente em 72 horas (< 1%); a MMP-9 diminui ate 12 horas (12%) e em 48 horas (2%), aumenta em 24 hs (> 20%) e normaliza em 72 horas (40%). Este estudo indica que a MMP-9 pode estar envolvida na clivagem do colageno XVIII renal e na liberacao da ES. Portanto, essas duas moleculas parecem compor um novo mecanismo de resposta celular (ligada a matriz) nesse modelo de injuria renal